Immunologisk påvisning af Helicobacter pylori

Helicobacter pylori-immunologiske tests detekterer H. pylori-infektion ved at måle Helicobacter pylori-antistoffer i serum, herunder passive hæmagglutineringsassays, immunoblotting-teknikker og enzymbundne immunosorbentassays (ELISA). Patienten tog cerebrospinalvæsken og fortyndede antigenet med en 96-brønds hæmagglutineringsplade med V-type for at fortynde JE-antigenet, således at hver brønd indeholdt 25 ul, og serumet, der skulle testes, blev fortyndet 1:10 med hver fortynding. Tilsæt 25 ml, tilsæt lyofiliseret japansk hjerne monoklonalt antistof for at sensibilisere røde blodlegemer fra får 25 ml, og observer resultaterne efter at have stået ved 37 ° C i flere timer. Grundlæggende information Specialistklassificering: klassifikation af vækst- og udviklingsundersøgelse: blodundersøgelse Gældende køn: om mænd og kvinder anvender faste: faste Tips: Hold tom mave fra eksamen. Normal værdi Resultatet var negativt. Klinisk betydning Unormale resultater: 1. Testens serumagglutinationstiter er 4 gange eller mere end 4 gange højere end antigenkontrollen. Serumantigentiteret i genopretningsperioden var 4 eller flere gange højere end den akutte fase og var positiv. 2. Der er en speciel farvereaktion, der beviser, at der findes et bestemt protein. 3. Forholdet mellem det serum, der skal testes, og det kendte negative serum (P / N) ≥ 2,1, og OD-værdien af ​​det serum, der skal testes, er ≥ 0,4, derefter bedømmes det som positivt. Behov for at kontrollere mængden: patienter med mavesår. Forholdsregler Kontraindikationer før inspektion: Vær opmærksom på at beskytte hjernen, klargør forskellige emballagevæsker og konfigurer koncentrationen. Tabu ved kontrol: 1. Patienten tager cerebrospinalvæsken til at sidde for ikke at skade hovedet. 2. Monoklonale antistoffer, der bruges til at sensibilisere røde blodlegemer fra får, der skal lyofiliseres før brug. 3. Fortynding, varighed af virkning og temperatur for de primære og sekundære antistoffer bør foreksperimenteres for at bestemme de optimale betingelser for forskellige proteiner. 4. Farveudviklingsopløsningen skal konfigureres frisk og til sidst tilføjes til H2O2. 5. DAB har potentialet til at forårsage kræft, så vær forsigtig, når du håndterer den. 6. Strenge kontrolfaktorer, der påvirker mærkningens effektivitet, såsom temperatur, tid, pH, enzym og antistofmængde. 7. Når du installerer søjlen, skal du gøre søjlen ensartet, cylinderoverfladen er flad, og der er ingen bobler eller revner. Inspektionsproces Først passiv blodkoagulation Patienten tog cerebrospinalvæsken og fortyndede antigenet med en 96-brønds hæmagglutineringsplade med V-type for at fortynde JE-antigenet, således at hver brønd indeholdt 25 ul, og serumet, der skulle testes, blev fortyndet 1:10 med hver fortynding. Tilsæt 25 ul og tilsæt 25 ul sensibiliserede fårrøde blodlegemer ved lyofiliseret japansk hjerne monoklonalt antistof, og observer resultaterne efter at have stået ved 37 ° C i flere timer. For det andet immunoblotting-teknologi (A) opnået proteinprøve: efter bakteriel induktion af ekspression kan cellerne lysiseres direkte ved hjælp af elektroforese-ladningsbuffer, eukaryotiske celler plus homogeniseringsbuffer, mekanisk eller ultralyd stuetemperaturhomogenat 0,5-1min. Det blev derefter centrifugeret ved 13.000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Tag supernatanten som en prøve. (2) Elektroforese: En elektroforesegel blev fremstillet og underkastet SDS-PAGE. (3) Transfer: (semi-dry transfer) 1. Når elektroforesen er færdig, skal du skære strimlen til den passende størrelse og ækvilibrere med membranbufferen, 5 minutter × 3 gange. 2. Membranbehandling: Filterpapiret og NC-membranen i samme størrelse som strimlen blev forudskåret og nedsænket i overførselsbufferen i 10 minutter. 3. Overførselsfilm: Filmoverførselsindretningen placeres i rækkefølge fra bund til top i henhold til rækkefølgen af ​​anode-carbonplade, 24 lag filterpapir, NC-film, gel, 24 lag filterpapir og katode-carbonplade. Filterpapir, gel og NC-film er præcist på linje. Boblerne blev fjernet i et trin, og en vægt på 500 g blev påført derpå for at tørre overskydende væske på carbonpladen. Tænd for strømmen, konstant strøm 1mA / cm2, overfør 1,5 time. Når overførslen er afsluttet, fjernes kraften, og membranen fjernes, og strimlen, der skal testes, skæres til immunblotting. Proteinstandardstrimlerne blev farvet, anbragt i membranfarvningsopløsningen i 50 s og derefter affarvet i 50% methanol flere gange til en klar baggrund, derefter vasket med dobbeltdestilleret vand, lufttørret i to lag filterpapir og overladt til farve Resultaterne sammenlignes. (4) Immunrespons: 1. Vask membranen med 0,01 M PBS i 5 minutter x 3 gange. 2. Tilsæt coatingopløsningen og ryst forsigtigt ved stuetemperatur i 2 timer. 3. Bortskaf opløsningen, og vask membranen med 0,01 M PBS i 5 minutter × 3 gange. 4. Tilsæt primært antistof (fortyndet med 0,01 M PBS i et passende fortyndingsforhold, væsken skal dække hele membranen) og lade stå ved 4 ° C i mere end 12 timer. I den negative kontrol blev det primære antistof erstattet med 1% BSA, og de resterende trin var de samme som i den eksperimentelle gruppe. 5. Kasser det primære antistof og 1% BSA, og vask membranen med 0,01 M PBS, 5 min × 4 gange. 6. Tilsæt peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (fortyndet med 0,01 M PBS ved det passende fortyndingsforhold) og ryst forsigtigt i 2 timer ved stuetemperatur. 7. Kasser det sekundære antistof, og vask membranen med 0,01 M PBS i 5 minutter × 4 gange. 8. Tilsæt farveløsningen, undgå lyset og udvikl farve, indtil båndet vises. Sæt det dobbeltdestillerede vand i for at stoppe reaktionen. For det tredje enzym kombineret adsorptionsbestemmelse Almindeligt anvendte ELISA-metoder inkluderer en sandwich-metode med dobbelt antistof og en indirekte metode, førstnævnte til påvisning af makromolekylære antigener og sidstnævnte til måling af specifikke antistoffer. Indirekte ELISA Denne metode bruges hovedsageligt til at detektere antistoffer. Proceduren for indirekte ELISA er som følger. (1) Materialer 1 belægningsvæske, vaskevæske, varmekonserveringsvæske, substratvæske og stopvæske; 2DVH-coatet antigen, enzymmærket anti-antistof, negativt og positivt DVH-referenceserum; 3 ELISA detektor, sampler, polystyrenmikroplade. (2) Metodetrin 1 plus antigenbelægning → 4 ° C natten over, vasket tre gange, kast tør; 2 plus serum, der skal testes → 37 ° C i 2 timer, vaskes tre gange, kastes tørt; 3 plus enzymmærket antistof → 37 ° C i 2 timer, vasket tre gange, kast tørt; 4 tilsæt substratopløsning → 37 ° C i 30 minutter, tilsæt stopopløsning; 5 OD-værdien blev målt med en ELISA-detektor, og P / N-forholdet blev beregnet. 2. Dobbelt antistofsandwich ELISA Denne metode bruges hovedsageligt til at detektere makromolekylære antigener. 1 plus antistofbelægning → 4 ° C natten over, vaskes tre gange, kastes tør; 2 plus antigenet, der skal testes → 37 ° C i 30 minutter, vaskes tre gange, kaste tørt; 3 plus enzymmærket antistof → 37 ° C i 30 minutter, vasket tre gange, kast tørt; 4 tilsæt substratopløsning → 37 ° C i 15 minutter, tilsæt stopopløsning; 5 OD-værdien blev målt ved en ELISA-tester. Ikke egnet til mængden Ikke egnet til kontrol af mængden: ingen. Bivirkninger og risici Ingen relaterede komplikationer eller farer.