웨스턴 블로팅

면역 블 롯팅은 단백질을 막으로 옮기고 항체를 사용한 후속 검출이다. 공지 된 발현 단백질의 경우, 해당 항체가 검출을위한 1 차 항체로 사용될 수 있으며, 새로운 유전자의 발현 생성물은 항체의 융합 부분에 의해 검출 될 수 있으며, 큰 분석 능력, 높은 감도, 강한 특이성 등의 이점이있다. 조직 항원의 정 성적 및 정량적 검출, 폴리펩티드 분자의 질량 결정, 및 바이러스의 항체 또는 항원의 검출과 같은 가장 일반적으로 사용되는 발현 및 분포 방법 중 하나. 기본 정보 전문가 분류 : 성장 및 개발 확인 분류 : 생화학 검사 해당 성별 : 남성과 여성의 금식 적용 여부 : 금식 팁 : 의사의 지시에 따르십시오. 정상 값 특별한 색 반응이 없습니다. 임상 적 의의 비정상 결과 : 특정 색 반응이있어 특정 단백질이 존재 함을 나타냅니다. 군중을 확인해야합니다 : 특정 단백질을 확인하십시오. 주의 사항 점검시 금기 : 없음. 점검시 금기 : 1 차 항체 및 2 차 항체의 희석, 작용 시간 및 온도는 상이한 단백질에 대한 최적 조건을 결정하기 위해 예비 실험에 의해 결정된다. 2. 발색 용액을 새로 구성하고 사용해야하며 H2O2가 추가됩니다. 3, DAB 발암 가능성이 있으므로 취급시주의하십시오. 검사 과정 (A) 수득 된 단백질 샘플 : 박테리아 발현의 유도 후, 세포는 전기 영동 로딩 완충제, 진핵 세포 + 균질화 완충제, 기계적 또는 초음파 실온 균질 물 0.5-1 분에 의해 직접 용해 될 수있다. 이어서, 4 ℃에서 15 분 동안 13,000g에서 원심 분리 하였다. 샘플로 상청액을 가져 가라. (2) 전기 영동 : 전기 영동 겔을 제조하고 SDS-PAGE를 수행 하였다. (3) 전송 : (반건식 전송) 1. 전기 영동이 완료된 후 스트립을 적절한 크기로 자르고 5 분 × 3 회 막 완충액과 평형을 이루십시오. 2. 막 처리 : 스트립과 동일한 크기의 여과지 및 NC 막을 사전 절단하고 전사 완충제에 10 분 동안 침지시켰다. 3. 전사 필름 : 필름 전사 장치는 양극 카본 플레이트, 24 층의 여과지, NC 필름, 젤, 24 층의 여과지 및 음극 카본 플레이트의 순서에 따라 아래에서 위로 순서대로 배치됩니다. 필터 페이퍼, 겔 및 NC 필름은 정확하게 정렬됩니다. 기포를 한번에 제거하고, 500g의 중량을 가하여 카본 플레이트상의 과량의 액체를 건조시켰다. 전원을 켜고 정전류 1mA / cm2를 1.5 시간 동안 전송합니다. 이송이 완료된 후, 전력이 제거되고 막이 제거되고, 시험 될 스트립은 면역 블 롯팅을 위해 절단된다. 단백질 표준 스트립을 염색하고, 50 초 동안 막 염색 용액에 넣은 다음, 50 % 메탄올에서 맑은 배경으로 여러 번 탈색 한 후, 이중 증류수로 세척하고, 두 층의 여과지에서 공기 건조시키고, 채색 하였다 결과가 비교됩니다. (4) 면역 반응 : 1. 막을 0.01 M PBS로 5 분 x 3 회 세척한다. 2. 코팅 용액을 넣고 실온에서 2 시간 동안 부드럽게 흔 듭니다. 3. 용액을 버리고 막을 0.01 M PBS로 5 분 × 3 회 세척한다. 4. 1 차 항체 (적절한 희석 비율로 0.01 M PBS로 희석, 액체는 모든 막을 덮어야 함)를 첨가하고 4 ℃에서 12 시간 이상 방치합니다. 음성 대조군에서, 1 차 항체는 1 % BSA로 대체되었고, 나머지 단계는 실험 그룹에서와 동일 하였다. 5. 1 차 항체 및 1 % BSA를 버리고, 막을 0.01 M PBS로 5 분 × 4 회 세척한다. 6. 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제-접합 된 이차 항체 (적절한 희석 비율에서 0.01 M PBS로 희석 됨)를 첨가하고 실온에서 2 시간 동안 부드럽게 진탕시킨다. 7. 이차 항체를 폐기하고 막을 0.01 M PBS로 5 분 × 4 회 세척한다. 8. 착색 용액을 넣고 빛을 피하고 밴드가 나타날 때까지 발색 한 후 이중 증류수에 넣어 반응을 중지시킵니다. 군중에게 적합하지 않음 군중에게 적합하지 않습니다. 부작용 및 위험 관련 합병증이나 위험이 없습니다.