Western blotting

Imunoblotting je přenos proteinů na membránu a následná detekce pomocí protilátek. U známého exprimovaného proteinu může být odpovídající protilátka použita jako primární protilátka pro detekci. Produkt exprese nového genu může být detekován fúzní částí protilátky a má výhody velké analytické kapacity, vysoké citlivosti, silné specificity atd. Jedna z nejčastěji používaných metod exprese a distribuce, jako je kvalitativní a kvantitativní detekce tkáňových antigenů, stanovení hmotnosti polypeptidových molekul a detekce protilátek nebo antigenů virů. Základní informace Odborná klasifikace: klasifikace kontroly růstu a vývoje: biochemické vyšetření Použitelné pohlaví: zda muži a ženy používají půst: ne půst Tipy: Řiďte se pokyny lékaře. Normální hodnota Žádné zvláštní barevné reakce. Klinický význam Abnormální výsledky: Existuje zvláštní barevná reakce, která prokazuje, že určitý protein existuje. Je třeba zkontrolovat dav: zkontrolovat určitý protein. Opatření Taboo při kontrole: Žádné. Tabu při kontrole: 1. Zředění, doba působení a teplota primární protilátky a sekundární protilátky se stanoví před experimentem, aby se stanovily optimální podmínky pro různé proteiny. 2. Roztok vyvíjející barvu musí být čerstvě nakonfigurován a použit a nakonec se přidá H2O2. 3, DAB má potenciál pro karcinogenitu, buďte při manipulaci opatrní. Proces inspekce (A) získaný vzorek proteinu: po bakteriální indukci exprese mohou být buňky přímo lyžovány elektroforézním nanášecím pufrem, eukaryotickými buňkami plus homogenizačním pufrem, mechanickým nebo ultrazvukovým homogenizátorem pokojové teploty 0,5 - 1 min. Poté byl odstřeďován při 13 000 g po dobu 15 minut při 4 ° C. Supernatant odeberte jako vzorek. (2) Elektroforéza: Byl připraven elektroforézní gel a byl podroben SDS-PAGE. 3) Transfer: (polosuchý transfer) 1. Poté, co je elektroforéza ukončena, ořízněte proužek na vhodnou velikost a ekvilibrujte membránovým pufrem, 5 x 3krát. 2. Zpracování membránou: Filtrační papír a NC membrána stejné velikosti jako proužek byly předem nařezány a ponořeny do přenosového pufru po dobu 10 minut. 3. Přenosový film: Zařízení pro přenos filmu je umístěno v pořadí zdola nahoru podle pořadí anodové uhlíkové desky, 24 vrstev filtračního papíru, NC filmu, gelu, 24 vrstev filtračního papíru a katodové uhlíkové desky. Filtrační papír, gel a NC film jsou přesně vyrovnány. Bubliny byly odstraněny v jednom kroku a bylo na ně naneseno závaží 500 g pro vysušení přebytečné kapaliny na uhlíkové desce. Zapněte napájení, konstantní proud 1 mA / cm2, přenos 1,5 hodiny. Po dokončení přenosu se síla odstraní a membrána se vyjme a testovaný proužek se odřízne pro imunoblotování. Proužky standardního proteinu byly obarveny, umístěny do roztoku pro barvení membrán na 50 sekund a poté několikrát odbarveny v 50% methanolu na čiré pozadí, poté promyty dvakrát destilovanou vodou, sušeny na vzduchu ve dvou vrstvách filtračního papíru a ponechány zbarvené Výsledky jsou porovnány. (4) Imunitní odpověď: 1. Promyjte membránu 0,01 M PBS po dobu 5 minut x 3x. 2. Přidejte potahovací roztok a jemně protřepávejte při pokojové teplotě po dobu 2 hodin. 3. Roztok zlikvidujte a membránu promyjte 0,01 M PBS po dobu 5 minut x 3krát. 4. Přidejte primární protilátku (zředěnou 0,01 M PBS ve vhodném ředicím poměru, kapalina musí pokrýt celou membránu) a nechte při 4 ° C déle než 12 hodin. V negativní kontrole byla primární protilátka nahrazena 1% BSA a zbývající kroky byly stejné jako v experimentální skupině. 5. Zlikvidujte primární protilátku a 1% BSA a promyjte membránu 0,01 M PBS, 5 min x 4krát. 6. Přidá se sekundární protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou (zředěná 0,01 M PBS ve vhodném ředicím poměru) a jemně protřepává 2 hodiny při teplotě místnosti. 7. Zlikvidujte sekundární protilátku a promyjte membránu 0,01 M PBS po dobu 5 minut x 4krát. 8. Přidejte barvicí roztok, vyhněte se světlu a vyvíjejte barvu, dokud se neobjeví pásek. Pro zastavení reakce přidejte dvakrát destilovanou vodu. Nevhodné pro dav Nevhodné pro dav: ne. Nežádoucí účinky a rizika Žádné související komplikace nebo rizika.