Análisis de ADN por citometría de flujo

El análisis de ADN por citometría de flujo es un método de examen que puede estudiar las células interfásicas y no se ve afectado por el estado de proliferación celular, y es importante para detectar células malignas en el derrame pleural. Rango de detección de citometría de flujo: 1. La citometría de flujo puede detectar la estructura celular, incluido el tamaño celular, el tamaño celular, el área de superficie celular, la relación nucleoplásmica, el contenido de ADN y el ciclo celular, el contenido de ARN y el contenido de proteínas. 2. La citometría de flujo puede detectar funciones celulares, incluidos antígenos específicos de superficie celular / citoplasmáticos / nucleares, actividades celulares, citocinas intracelulares, actividades enzimáticas, sitios de unión a hormonas y receptores celulares. Información básica Clasificación del especialista: clasificación del examen cardiovascular: examen de sangre Género aplicable: si los hombres y las mujeres aplican en ayunas: no en ayunas Consejos: mantenga una mentalidad normal. Valor normal El cuerpo está en un equilibrio dinámico sin enfermedad. Importancia clínica Aplicación clínica de citometría de flujo: 1. Aplicación de citometría de flujo en oncología La citometría de flujo puede detectar el ciclo de proliferación de células tumorales, detectar marcadores de superficie de células tumorales, productos de expresión de oncogenes, realizar análisis de resistencia a múltiples fármacos y detectar apoptosis; 2. Aplicación de citometría de flujo en hematología para detectar células de leucemia y linfoma, plaquetas activadas, recuentos de células madre hematopoyéticas (CD34 +), inmunofenotipaje de leucemias y linfomas, recuentos de reticulocitos, comparación cruzada de trasplante de células y Monitoreo del estado inmune; 3. La citometría de flujo en inmunología puede usarse para linfocitos y su análisis de subgrupos, inmunofenotipado de linfocitos, detección de citocinas. Resultados anormales Hubo datos sobre el análisis de citometría de flujo de 71 casos de derrame pleural Los resultados mostraron que la sensibilidad del derrame pleural maligno fue del 52% y la especificidad fue del 100%. Si se usa junto con pruebas de rutina, la sensibilidad del diagnóstico puede llegar al 94%. El análisis de ADN de las células cancerosas de derrame pleural mostró un aumento en la proporción de células aneuploides y fase S, fase G2 / M. Se sospecha que las personas que necesitan ser examinadas tienen derrame pleural canceroso y otras enfermedades relacionadas. Precauciones La citometría de flujo no es un instrumento totalmente automatizado. Los resultados experimentales precisos requieren técnicas manuales precisas. Por lo tanto, la preparación de la muestra requiere especificación y el propio instrumento requiere control de calidad. (1) Factores influyentes y control de calidad de la detección inmunológica por citometría de flujo. La citometría de flujo tiene una amplia gama de aplicaciones en inmunología: la preparación de muestras de tinción inmunofluorescente es muy importante, a menudo debido a la aparición de interferencia de fluorescencia no específica antropogénica (especialmente en la tinción de inmunofluorescencia indirecta) o baja concentración celular durante la preparación de la muestra. Resultados de la prueba Las soluciones a estos factores influyentes son las siguientes: (1) Asegúrese de que la concentración de la muestra antes de que se detecte la máquina sea 1X106 células / ml, y que la concentración celular sea demasiado baja, lo que afecta directamente el resultado de la detección. (2) El uso de agentes de bloqueo de proteínas para bloquear sitios de unión no específicos es especialmente necesario para el marcado de inmunofluorescencia indirecta. Los agentes bloqueantes de proteínas usados ​​comúnmente son albúmina de suero bovino al 0,5% y suero bovino fetal al 1%. (3) El anticuerpo fluorescente se lava a fondo después de la tinción, presta atención a la velocidad de mezcla y centrifugación, y reduce la superposición de células y desechos celulares. (4) Se configuró una muestra de control utilizando un control de fondo de control no relacionado y anticuerpos fluorescentes que coincidían con la misma fuente de anticuerpo. (5) Al juzgar el resultado, se debe prestar atención a restar la fluorescencia de fondo. Para hacer que el análisis cuantitativo de la inmunofluorescencia sea más preciso, el software del programa de computadora se utiliza para restar el pico de la curva del grupo de control del pico de la curva del grupo experimental mediante el método de la curva de ajuste. Se pueden obtener resultados cuantitativos de inmunofluorescencia más precisos. (6) Preste atención a evitar la luz después del teñido para garantizar la estabilidad de la inmunofluorescencia celular. (2) Todavía no existe un estándar uniforme para el control de calidad del análisis de ploidía del ADN. Los resultados experimentales informados en varias publicaciones son bastante diferentes. En octubre de 1993, la Organización Americana de Investigación del Cáncer desarrolló un estándar unificado para la determinación del ADN de FCM, que combinamos de acuerdo con estos estándares. Expertos experimentados han practicado durante muchos años para explicar el control de calidad y las precauciones de la tecnología de análisis de ADN de FCM. (1) Cuando se toman muestras frescas para resección quirúrgica o agujas de biopsia, se debe evitar el tejido necrótico hemorrágico. (2) Las muestras se deben fijar o crioconservar a tiempo después de la recolección para evitar la autólisis y la degradación del ADN, lo que resulta en errores en los resultados de las pruebas. (3) El fijador debe adoptar una concentración que sea altamente penetrante en las células del tejido, y el 70% del etanol es mejor. (4) Durante la preparación de la suspensión de células individuales, tenga cuidado de separar los componentes de las células a analizar, reduzca la interferencia de otros componentes y tenga cuidado de no dañar las células. (5) La recolección de muestras de células debe garantizar una concentración celular suficiente, es decir, 1 × 10 6 células / ml, las impurezas, los desechos, las acumulaciones y las células superpuestas deben ser <2%, y al menos el 20% de las muestras de aneuploides de ADN de células tumorales deben analizarse. Las células tumorales están presentes. (6) Al preparar la célula individual de tejido embebido en parafina, se debe prestar atención a la selección del tejido sin autólisis y necrosis. Para la muestra de tejido tumoral, se selecciona el área que contiene las células tumorales; el grosor de la lámina de tejido de parafina debe ser adecuado, preferiblemente 40 a 50 μm. Las rodajas excesivamente delgadas o demasiado gruesas afectarán los resultados de la prueba; se desparafinará completamente para evitar que la parafina residual afecte la actividad digestiva de la enzima. Verifique que el desparafinado se complete descartando xileno y agregando 100% de etanol. Flotante, lo que indica que la cera se ha eliminado; la hidratación es suficiente para restaurar el tejido a un estado similar al tejido fresco; preste atención al tiempo de digestión y la actividad de las enzimas digestivas. Se usó rutinariamente pepsina al 0,5%, pH 1,5. (3) Aspectos operacionales (1) El citómetro de flujo está en un estado óptimo durante todo el proceso de trabajo, lo que puede garantizar la precisión y exactitud de la detección cuantitativa. Usando la muestra estándar para ajustar el coeficiente de variación del instrumento al rango mínimo, la resolución está en el mejor estado, para evitar errores de detección causados ​​por cambios en las condiciones del instrumento durante el proceso de medición. (2) El índice importante para evaluar la precisión del instrumento es el coeficiente de variación (CV) del instrumento.Para la muestra de calibración, cuanto menor es el valor CV, menor es el valor CV, lo que indica que la precisión de la calibración del instrumento es mayor. Las muestras de calibración incluyen muestras no biológicas (microesferas fluorescentes) y muestras de células biológicas (linfocitos humanos, glóbulos rojos de pollo, etc.). En la actualidad, las microesferas no bioluminiscentes tienen reactivos comerciales, y el CV generalmente es <2% a 3%. (4) Análisis de datos (1) Cuando hay demasiados desechos o aglomerados en la muestra, el número de células medidas es inferior al 20%, y la línea base del histograma debe abandonarse. (2) Cuando se realiza el análisis del ciclo celular, el número de células de muestra debe ser de 10,000, excluyendo escombros, impurezas y aglomerados. Cuando el número de células aneuploides representa menos del 10% del número total de células, es necesario combinar otros indicadores de diagnóstico. En conclusión, al menos las células aneuploides representan más del 20% del número total de células, y se puede determinar la presencia de aneuploides. (3) En el análisis de ADN, el análisis se abandonó cuando el valor CV del grupo de células diploides normales era> 8%, pero el valor CV de las células tumorales era> 8%, lo que estaba relacionado con la heterogeneidad de las células tumorales. Además, en el análisis de ploidía del ADN, el 10% de los individuos en el tejido homólogo se desplazarán. (4) Control de calidad de los patrones de ploidía de ADN, utilizando el mismo tejido normal homólogo individual, el mismo método de fijación, el mismo método de procesamiento de muestras, el mismo método de tinción, tinción simultánea, las mismas condiciones de detección del instrumento, tejido diploide normal que Norma interna Proceso de inspección Análisis de citometría de flujo: las células en líquido pleural se tiñeron directamente con colorantes fluorescentes (como yoduro de propidio), y el contenido de ADN, la distribución del ciclo celular y la ploidía de ADN de las células de líquido pleural se analizaron mediante citometría de flujo. Preparación de muestras para pruebas de rutina por citometría de flujo: (1) Etiquetado de inmunofluorescencia directa Tome una cierta cantidad de células (aproximadamente 1X106 células / ml), agregue directamente el anticuerpo conjugado con fluoresceína para la reacción de inmunomarcaje (como la tinción con doble o múltiples etiquetas, agregue varios anticuerpos marcados con diferentes fluoresceína al mismo tiempo), incube Después de 20 a 60 minutos, lave con PBS (pH 7,2 a 7,4) durante 1 o 2 veces, resuspenda en tampón y pruebe en la máquina. El método tiene las ventajas de una operación simple, un resultado preciso y un análisis fácil, y es adecuado para la determinación simultánea de múltiples parámetros del mismo grupo celular. Aunque el costo del reactivo de anticuerpo marcado directamente es alto, reduce la interferencia de fluorescencia no específica fuerte en el método de marcado indirecto y, por lo tanto, es más adecuado para la detección de muestras clínicas. (dos) etiquetado de inmunofluorescencia indirecta Tome una cierta cantidad de suspensión celular (aproximadamente 1X106 células / ml), primero agregue un primer anticuerpo específico, lave el anticuerpo no unido después de que se complete la reacción y luego agregue un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia para formar un complejo antígeno-anticuerpo-anticuerpo El FCM detecta la fluorescencia emitida por la fluoresceína marcada después de que se excita. El método es de bajo costo, y el anticuerpo secundario se usa ampliamente, y se usa principalmente para la detección de muestras científicas. Sin embargo, dado que el anticuerpo secundario es generalmente un anticuerpo policlonal, la especificidad es pobre y el fondo fluorescente no específico es fuerte, lo que afecta fácilmente los resultados experimentales. Por lo tanto, se debe agregar un control negativo o positivo a la preparación de la muestra. Además, debido a la gran cantidad de pasos en el método de etiquetado estándar, aumenta la pérdida de células y no es adecuado medir muestras con un pequeño número de células. No apto para la multitud. No