Analyse d'ADN par cytométrie en flux

L'analyse cytométrique en flux de l'ADN est une méthode d'examen qui peut étudier les cellules en interphase. Elle n'est pas affectée par l'état de prolifération cellulaire. Elle est importante pour la détection des cellules malignes dans les épanchements pleuraux. Domaine de détection par cytométrie en flux: 1. La cytométrie en flux peut détecter la structure cellulaire, y compris la taille, la surface, le rapport nucléoplasmique, le contenu en ADN et le cycle cellulaire, le contenu en ARN, le contenu en protéines. 2. La cytométrie en flux peut détecter des fonctions cellulaires, notamment des antigènes spécifiques de la surface cellulaire / cytoplasmiques / nucléaires, des activités cellulaires, des cytokines intracellulaires, des activités enzymatiques, des sites de liaison hormonale et des récepteurs cellulaires. Informations de base Classification de spécialiste: classification de l'examen cardiovasculaire: examen du sang Sexe applicable: si les hommes et les femmes appliquent le jeûne: pas le jeûne Conseils: Gardez un état d'esprit normal. Valeur normale Le corps est dans un équilibre dynamique sans maladie. Signification clinique Application clinique de la cytométrie en flux: 1. Application de la cytométrie en flux en oncologie La cytométrie en flux peut détecter le cycle de prolifération des cellules tumorales, détecter les marqueurs de surface des cellules tumorales, les produits d'expression de l'oncogène, effectuer une analyse de résistance à plusieurs médicaments et détecter l'apoptose; 2. Application de la cytométrie en flux en hématologie pour détecter les cellules de leucémie et de lymphome, les plaquettes activées, les numérations de cellules souches hématopoïétiques (CD34 +), l'immunophénotypage des leucémies et des lymphomes, la numération des réticulocytes, la correspondance des transplantations cellulaires, et Surveillance du statut immunitaire; 3. La cytométrie en flux en immunologie peut être utilisée pour l'analyse des lymphocytes et de ses sous-groupes, l'immunophénotypage des lymphocytes, la détection des cytokines. Résultats anormaux L'analyse par cytométrie en flux de 71 cas d'épanchement pleural a révélé que la sensibilité de l'épanchement pleural malin était de 52% et la spécificité de 100%. Utilisé conjointement avec des tests de routine, la sensibilité du diagnostic peut atteindre 94%. L'analyse de l'ADN des cellules cancéreuses d'épanchement pleural a montré une augmentation de la proportion de cellules aneuploïdes et en phase S, phase G2 / M. Les personnes qui doivent être examinées sont suspectées d'épanchement pleural cancéreux et d'autres maladies apparentées. Précautions La cytométrie en flux n'est pas un instrument entièrement automatisé. Des résultats expérimentaux précis nécessitent des techniques manuelles précises. Par conséquent, la préparation des échantillons doit être spécifiée et l'instrument lui-même nécessite un contrôle de la qualité. (1) Facteurs d'influence et contrôle de la qualité de la détection immunologique par cytométrie en flux La cytométrie en flux a de nombreuses applications en immunologie: la préparation d’échantillons par coloration immunofluorescente est très importante, souvent en raison de l’interférence anthropique non spécifique de la fluorescence (notamment dans la coloration par immunofluorescence indirecte) ou d’une faible concentration cellulaire lors de la préparation des échantillons. Résultats du test. Les solutions à ces facteurs d'influence sont les suivantes: (1) Assurez-vous que la concentration de l'échantillon avant la détection de la machine est de 1 x 106 cellules / ml et que sa concentration est trop faible, ce qui affecte directement le résultat de la détection. (2) L'utilisation d'agents bloquant les protéines pour bloquer les sites de liaison non spécifiques est particulièrement nécessaire pour le marquage indirect par immunofluorescence. Les agents bloquant les protéines couramment utilisés sont l’albumine bovine à 0,5% et le sérum bovin fœtal à 1%. (3) Après la coloration, les anticorps fluorescents sont lavés à fond. Faites attention au mélange et à la vitesse de centrifugation et réduisez le chevauchement des cellules et des débris cellulaires. (4) Un échantillon de contrôle a été établi en utilisant un contrôle de fond d'anticorps de contrôle non apparentés et d'anticorps fluorescents correspondant à la même source d'anticorps. (5) Lors de l'évaluation du résultat, il convient de soustraire la fluorescence d'arrière-plan.Afin de rendre l'analyse quantitative de l'immunofluorescence plus précise, le logiciel est utilisé pour soustraire le pic de courbe du groupe témoin du pic de courbe du groupe expérimental par la méthode de la courbe d'ajustement. Des résultats quantitatifs d'immunofluorescence plus précis peuvent être obtenus. (6) Faites attention à éviter la lumière après la teinture pour assurer la stabilité de l'immunofluorescence cellulaire. (2) Il n’existe toujours pas de norme uniforme pour le contrôle de la qualité de l’analyse de la ploïdie ADN. Les résultats expérimentaux présentés dans diverses littératures sont très différents. En octobre 1993, l’American Cancer Research Organization a mis au point une norme unifiée pour la détermination de l’ADN de la FCM, que nous avons combinée selon ces normes. Des experts expérimentés pratiquent depuis de nombreuses années pour expliquer le contrôle de la qualité et les précautions de la technologie d'analyse de l'ADN de la FCM. (1) Lors de la prise d'échantillons frais pour des aiguilles de résection chirurgicale ou de biopsie, le tissu nécrotique hémorragique doit être évité. (2) Les échantillons doivent être fixés ou cryoconservés peu de temps après le prélèvement pour éviter l'autolyse et la dégradation de l'ADN, ce qui entraînerait des erreurs dans les résultats des tests. (3) Le fixateur doit adopter une concentration très pénétrante dans les cellules du tissu et 70% de l'éthanol est préférable. (4) Lors de la préparation d'une suspension cellulaire unique, veillez à séparer les composants des cellules à tester, réduisez les interférences des autres composants et veillez à ne pas endommager les cellules. (5) La collecte des échantillons cellulaires devrait garantir une concentration cellulaire suffisante, soit 1 × 10 6 cellules / ml. Les impuretés, les débris, les touffes et les cellules superposées devraient être <2% et au moins 20% des échantillons d’aneuploïdes ADN des cellules tumorales devraient être analysés. Les cellules tumorales sont présentes. (6) Lors de la préparation de la cellule unique de tissu inclus dans la paraffine, il convient de choisir avec soin le tissu sans autolyse ni nécrose, en sélectionnant la zone contenant les cellules tumorales et l'épaisseur de la feuille de tissu en paraffine appropriée, de préférence 40 à 50 µm. Des tranches excessivement minces ou trop épaisses affecteront les résultats du test; déparaffinez minutieusement pour éviter que la paraffine résiduelle affecte l'activité digestive de l'enzyme Vérifiez que le déparaffinage est terminé en éliminant le xylène et en ajoutant 100% d'éthanol. Flottante, indiquant que la cire a été retirée; l'hydratation est suffisante pour rétablir le tissu dans un état similaire à celui du tissu frais; faites attention au moment de la digestion et à l'activité des enzymes digestives. 0,5% de pepsine a été utilisé en routine, pH 1,5. (3) Aspects opérationnels (1) Le cytomètre en flux est dans un état optimal tout au long du processus de travail, ce qui peut assurer l'exactitude et la précision de la détection quantitative. En utilisant l'échantillon standard pour ajuster le coefficient de variation de l'instrument à la plage minimale, la résolution est dans le meilleur état possible, afin d'éviter les erreurs de détection causées par des modifications des conditions de l'instrument pendant le processus de mesure. (2) L'indice important pour évaluer la précision de l'instrument est le coefficient de variation (CV) de l'instrument.Pour l'échantillon d'étalonnage, plus la valeur CV est petite, plus la valeur CV est petite, ce qui indique que la précision de l'étalonnage de l'instrument est supérieure. Les échantillons d'étalonnage comprennent des échantillons non biologiques (microsphères fluorescentes) et des échantillons de cellules biologiques (lymphocytes humains, globules rouges de poulet, etc.). À l'heure actuelle, les microsphères non bioluminescentes ont des réactifs commerciaux et leur CV est généralement inférieur à 2% à 3%. (4) analyse des données (1) Lorsqu'il y a trop de débris ou d'agglomérats dans l'échantillon, le nombre de cellules mesurées est inférieur à 20% et l'histogramme initial doit être abandonné. (2) Lors de l'analyse du cycle cellulaire, le nombre de cellules de l'échantillon doit être de 10 000, débris, impuretés et agglomérats compris.Lorsque le nombre de cellules aneuploïdes représente moins de 10% du nombre total de cellules, il est nécessaire de combiner d'autres indicateurs de diagnostic. En conclusion, au moins les cellules aneuploïdes représentent plus de 20% du nombre total de cellules et la présence d'aneuploïdes peut être déterminée. (3) Dans l'analyse de l'ADN, l'analyse a été abandonnée lorsque la valeur CV du groupe de cellules diploïdes normales était> 8%, mais que la valeur CV des cellules tumorales était> 8%, ce qui était lié à l'hétérogénéité des cellules tumorales. De plus, dans l'analyse de la ploïdie de l'ADN, 10% des individus du tissu homologue vont dériver. (4) Contrôle de la qualité des normes de ploïdie de l'ADN, en utilisant le même tissu normal homologue individuel, la même méthode de fixation, la même méthode de traitement des échantillons, la même méthode de coloration, la coloration simultanée, les mêmes conditions de détection de l'instrument, le tissu diploïde normal Standard interne. Processus d'inspection Analyse par cytométrie en flux: les cellules du liquide pleural ont été directement colorées avec des colorants fluorescents (tels que l'iodure de propidium) et le contenu en ADN, la distribution du cycle cellulaire et la ploïdie ADN des cellules du liquide pleural ont été analysés par cytométrie en flux. Préparation des échantillons pour les tests de routine par cytométrie en flux: (1) Marquage par immunofluorescence directe Prenez une certaine quantité de cellules (environ 1 x 106 cellules / ml), ajoutez directement l'anticorps conjugué à la fluorescéine pour la réaction d'immunomarquage (telle qu'une coloration à double marquage ou à marquages ​​multiples, ajoutez plusieurs anticorps marqués avec de la fluorescéine en même temps), incubez Après 20 à 60 minutes, laver avec du PBS (pH 7,2 à 7,4) pendant 1 ou 2 fois, remettre en suspension dans du tampon et tester sur la machine. La méthode présente les avantages d'une opération simple, d'un résultat précis et d'une analyse facile, et convient à la détermination simultanée de plusieurs paramètres du même groupe de cellules. Bien que le coût du réactif anticorps marqué directement soit élevé, il réduit l’interférence de la fluorescence non spécifique forte dans la méthode de marquage indirect, et convient donc mieux à la détection des échantillons cliniques. (deux) marquage par immunofluorescence indirecte Prenez une certaine quantité de suspension cellulaire (environ 1 x 106 cellules / ml), ajoutez d'abord un premier anticorps spécifique, lavez l'anticorps non lié une fois la réaction terminée, puis ajoutez un anticorps secondaire marqué par fluorescence pour former un complexe antigène-anticorps-anticorps. Le FCM détecte la fluorescence émise par la fluorescéine marquée après son excitation. La méthode est peu coûteuse et l'anticorps secondaire est largement utilisé et est principalement utilisé pour la détection de spécimens scientifiques. Cependant, comme l'anticorps secondaire est généralement un anticorps polyclonal, la spécificité est médiocre et le fond fluorescent non spécifique est puissant, ce qui affecte facilement les résultats expérimentaux. Par conséquent, un contrôle négatif ou positif doit être ajouté à la préparation de l'échantillon. De plus, en raison du grand nombre d'étapes de la méthode de marquage standard, la perte de cellules est augmentée et il n'est pas approprié de mesurer des échantillons avec un petit nombre de cellules. Ne convient pas à la foule Non