Détection immunologique de Helicobacter pylori

Les tests immunologiques à Helicobacter pylori détectent l'infection à H. pylori en mesurant les anticorps sériques à Helicobacter pylori, y compris les tests d'hémagglutination passive, les techniques d'immunoempreinte et les tests d'immunosorbant lié à une enzyme (ELISA). Le patient a pris le liquide céphalo-rachidien et dilué l'antigène avec la plaque d'hémagglutination de type V à 96 puits pour diluer l'antigène JE, de sorte que chaque puits contienne 25 µL et que le sérum à tester soit dilué à 1/10 à chaque dilution. Ajoutez 25 µL, ajoutez un anticorps monoclonal du cerveau japonais lyophilisé pour sensibiliser les globules rouges de mouton 25 µL, et observez les résultats après une immersion à 37 ° C pendant plusieurs heures. Informations de base Classification de spécialiste: classification d'examen de croissance et de développement: analyse de sang Sexe applicable: si les hommes et les femmes appliquent le jeûne: le jeûne Conseils: Gardez l'estomac vide de l'examen. Valeur normale Le résultat était négatif. Signification clinique Résultats anormaux: 1. Le titre sérique d'agglutination du test est 4 fois ou plus de 4 fois supérieur au contrôle antigène. Le titre de l'antigène sérique au cours de la période de récupération était 4 fois plus élevé que la phase aiguë et était positif. 2. Il y a une réaction colorée spéciale, qui prouve qu'une certaine protéine existe. 3. Le rapport du sérum à tester sur le sérum négatif connu (P / N) ≥ 2,1 et la valeur DO du sérum à tester est ≥ 0,4; il est alors jugé positif. Besoin de vérifier la foule: les patients atteints d'ulcère peptique. Précautions Contre-indications avant inspection: Veillez à protéger le cerveau, préparez différents liquides d’emballage et configurez la concentration. Tabou lors de la vérification: 1. Le patient prend le liquide céphalo-rachidien pour s'asseoir, afin de ne pas blesser la tête. 2. Les anticorps monoclonaux utilisés pour sensibiliser les globules rouges de mouton à lyophiliser avant utilisation. 3. La dilution, la durée d'action et la température des anticorps primaires et secondaires doivent être préalablement expérimentées afin de déterminer les conditions optimales pour différentes protéines. 4. La solution de développement des couleurs doit être fraîchement configurée et finalement ajoutée à H2O2. 5. Le DAB a le potentiel de causer le cancer, soyez donc prudent lorsque vous le manipulez. 6. Des facteurs de contrôle stricts affectant l'efficacité du marquage, tels que la température, la durée, le pH, l'enzyme et la quantité d'anticorps. 7. Lors de l'installation de la colonne, uniformisez-la, la surface du cylindre est plate et il n'y a pas de bulles ni de fissures. Processus d'inspection Tout d'abord, la coagulation sanguine passive Le patient a pris le liquide céphalo-rachidien et dilué l'antigène avec la plaque d'hémagglutination de type V à 96 puits pour diluer l'antigène JE, de sorte que chaque puits contienne 25 µL et que le sérum à tester soit dilué au 1/10 à chaque dilution. Ajoutez 25 µL et 25 µL de globules rouges de mouton sensibilisés à l'aide d'un anticorps monoclonal du cerveau japonais lyophilisé et observez les résultats après plusieurs heures de repos à 37 ° C. Deuxièmement, la technologie d'immunoblot (A) échantillon de protéine obtenu: après l'induction d'expression bactérienne, les cellules peuvent être directement lysées par un tampon de charge pour électrophorèse, des cellules eucaryotes et un tampon d'homogénéisation, un homogénat à température ambiante mécanique ou à ultrasons de 0,5 à 1 min. Il a ensuite été centrifugé à 13 000 g pendant 15 min à 4 ° C. Prenez le surnageant comme échantillon. (2) Electrophorèse: un gel d'électrophorèse a été préparé et soumis à une SDS-PAGE. (3) Transfert: (transfert semi-sec) 1. Une fois l'électrophorèse terminée, coupez la bande à la taille appropriée et équilibrez-la avec le tampon de membrane 5 fois par 3 fois. 2. Traitement par membrane: le papier filtre et la membrane NC de la même taille que la bande ont été prédécoupés et immergés dans le tampon de transfert pendant 10 min. 3. Film de transfert: Le dispositif de transfert de film est placé dans l'ordre, de bas en haut, selon l'ordre suivant: plaque de carbone anodique, 24 couches de papier filtre, film CN, gel, 24 couches de papier filtre et plaque de carbone cathodique, le papier filtre, le gel et le film NC étant alignés avec précision. Les bulles ont été éliminées en une étape et un poids de 500 g y a été appliqué pour sécher le liquide en excès sur la plaque de carbone. Mettez sous tension, courant constant 1mA / cm2, transférez 1,5 heure. Une fois le transfert terminé, l’alimentation est coupée, la membrane retirée et la bande à tester est découpée pour immunoblot. Les bandes de protéines standard ont été colorées, placées dans la solution de coloration membranaire pendant 50 secondes, puis décolorées plusieurs fois dans un mélange de méthanol à 50% jusqu'à obtenir un fond transparent, puis lavées avec de l'eau bidistillée, séchées à l'air dans deux couches de papier filtre et laissées à colorer. Les résultats sont comparés. (4) réponse immunitaire: 1. Laver la membrane avec du PBS 0,01 M pendant 5 min x 3 fois. 2. Ajouter la solution de revêtement et agiter doucement à la température ambiante pendant 2 heures. 3. Jeter la solution et laver la membrane avec du PBS 0,01 M pendant 5 min × 3 fois. 4. Ajouter l'anticorps primaire (dilué avec du PBS 0,01 M dans un rapport de dilution approprié, le liquide doit recouvrir toute la membrane) et laisser à 4 ° C pendant plus de 12 heures. Dans le contrôle négatif, l'anticorps primaire a été remplacé par 1% de BSA et les étapes restantes étaient les mêmes que dans le groupe expérimental. 5. Jeter l'anticorps primaire et 1% de BSA et laver la membrane avec du PBS 0,01 M, 5 min x 4 fois. 6. Ajouter l'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (dilué avec du PBS 0,01 M au rapport de dilution approprié) et agiter doucement pendant 2 heures à la température ambiante. 7. Jeter l'anticorps secondaire et laver la membrane avec du PBS 0,01 M pendant 5 min x 4 fois. 8. Ajoutez la solution de coloration, évitez la lumière et développez la couleur jusqu'à ce que la bande apparaisse. Mettez dans l'eau bidistillée pour arrêter la réaction. Troisièmement, détermination par adsorption combinée d'enzymes Les méthodes ELISA couramment utilisées comprennent une méthode sandwich à double anticorps et une méthode indirecte, la première pour détecter les antigènes macromoléculaires et la seconde pour mesurer les anticorps spécifiques. ELISA indirect Cette méthode est principalement utilisée pour détecter des anticorps. La procédure d’ELISA indirect est la suivante. (1) matériaux 1 liquide de revêtement, liquide de lavage, liquide de conservation de la chaleur, liquide de substrat et liquide d'arrêt; Antigène revêtu de 2DVH, anticorps anti-anticorps marqués, sérum de référence DVH positif et négatif; 3 Détecteur ELISA, échantillonneur, microplaque en polystyrène. (2) étapes de la méthode 1 couche d'antigène plus → 4 ° C pendant une nuit, lavée trois fois, sécher à sec; 2 plus sérum à tester → 37 ° C pendant 2 heures, lavé trois fois, séché au jet; 3 anticorps anticorps plus marqués → 37 ° C pendant 2 heures, lavés trois fois, séchés au jet; 4 ajouter la solution de substrat → 37 ° C pendant 30 minutes, ajouter la solution d'arrêt; 5 La valeur OD a été mesurée par un détecteur ELISA et le rapport P / N a été calculé. 2. ELISA sandwich double anticorps Cette méthode est principalement utilisée pour détecter les antigènes macromoléculaires. 1 plus anticorps revêtement → 4 ° C pendant la nuit, lavé trois fois, sécher à sec; 2 plus l'antigène à tester → 37 ° C pendant 30 minutes, lavé trois fois, séché au jet; 3 anticorps anticorps plus marqués → 37 ° C pendant 30 minutes, lavés trois fois, séchés par jet; 4 ajouter la solution de substrat → 37 ° C pendant 15 minutes, ajouter la solution d'arrêt; 5 La valeur de la densité optique a été mesurée par un testeur ELISA. Ne convient pas à la foule Ne convient pas pour vérifier la foule: aucune. Effets indésirables et risques Aucune complication ou danger associé.