フローサイトメトリー DNA 分析

フローサイトメトリーDNA分析は、間期細胞を研究できる検査法であり、細胞増殖の状態に影響されず、胸水中の悪性細胞の検出に重要です。 フローサイトメトリー検出範囲：1.フローサイトメトリーは、細胞サイズ、細胞サイズ、細胞表面積、核質比、DNA含有量と細胞周期、RNA含有量、タンパク質含有量などの細胞構造を検出できます。 2.フローサイトメトリーは、細胞表面/細胞質/核特異抗原、細胞活性、細胞内サイトカイン、酵素活性、ホルモン結合部位、細胞受容体などの細胞機能を検出できます。 基本情報 専門家分類：心血管検査分類：血液検査 該当する性別：男性と女性が断食を適用するかどうか：断食をしない ヒント：通常の考え方を維持します。 正常値 体は病気のないダイナミックなバランスにあります。 臨床的意義 フローサイトメトリーの臨床応用： 1.腫瘍学におけるフローサイトメトリーの応用フローサイトメトリーは、腫瘍細胞増殖サイクルの検出、腫瘍細胞表面マーカー、癌遺伝子発現産物の検出、多剤耐性分析の実施、アポトーシスの検出ができます。 2.白血病およびリンパ腫細胞、活性化血小板、造血幹細胞（CD34 +）カウント、白血病およびリンパ腫の免疫表現型、網状赤血球カウント、細胞移植の交差照合を検出するための血液学におけるフローサイトメトリーの応用免疫状態監視; 3.免疫学のフローサイトメトリーは、リンパ球およびそのサブグループ分析、リンパ球免疫表現型分類、サイトカインの検出に使用できます。 異常な結果胸水71症例のフローサイトメトリー分析に関するデータがあり、悪性胸水の感度は52％、特異性は100％であることが示された。 日常の検査と併用すると、診断の感度は94％にもなります。 癌性胸水細胞のDNA分析により、異数性およびS期、G2 / M期細胞の割合の増加が示されました。 検査が必要な人は、癌性胸水およびその他の関連疾患の疑いがあります。 注意事項 フローサイトメトリーは完全に自動化された機器ではなく、正確な実験結果を得るには正確な手動技術が必要であるため、標本の準備には仕様が必要で、機器自体には品質管理が必要です。 （1）フローサイトメトリー免疫学的検出の影響因子と品質管理 フローサイトメトリーには、免疫学における幅広い用途があります。免疫蛍光染色標本の調製は、人為的非特異的蛍光干渉（特に間接免疫蛍光染色）の発生または標本調製中の低細胞濃度のために非常に重要です。テスト結果。 これらの影響要因の解決策は次のとおりです。 （1）機械が検出される前の検体の濃度が1X106 cells / mlであり、細胞濃度が低すぎるため、検出結果に直接影響することを確認します。 （2）非特異的結合部位をブロックするタンパク質ブロッキング剤の使用は、間接免疫蛍光標識に特に必要です。 一般的に使用されるタンパク質ブロッキング剤は、0.5％ウシ血清アルブミンと1％ウシ胎児血清です。 （3）染色後に蛍光抗体を完全に洗浄し、混合と遠心分離の速度に注意を払い、重複する細胞と細胞片を減らします。 （4）無関係のコントロールのバックグラウンドコントロールと同じ抗体源に一致する蛍光抗体を使用して、コントロールサンプルを設定しました。 （5）結果を判断する際には、バックグラウンド蛍光の減算に注意する必要があります。免疫蛍光の定量分析をより正確にするために、コンピュータープログラムソフトウェアを使用して、フィッティングカーブ法により、実験群の曲線ピークから対照群の曲線ピークを減算します。より正確な免疫蛍光定量結果が得られます。 （6）細胞免疫蛍光の安定性を確保するために、染色後は光を避けてください。 （2）DNA倍数性分析の品質管理に関する統一された標準はまだありません。さまざまな文献で報告されている実験結果はまったく異なります.1993年10月に、米国癌研究機構はFCM DNAの決定のための統一された標準を開発し、これらの標準に従って組み合わせました。経験豊富な専門家は、FCMのDNA分析技術の品質管理と注意事項を説明するために長年練習してきました。 （1）外科的切除または生検針用の新鮮な標本を採取する場合、出血性壊死組織を避ける必要があります。 （2）検体は、自己分解およびDNA分解を避けるために、採取後の時間に固定または凍結保存する必要があります。これにより、試験結果に誤りが生じます。 （3）固定液は、組織細胞に非常に浸透する濃度を採用する必要があり、エタノールの70％がより適切です。 （4）単細胞懸濁液の調製中、試験する細胞の成分を分離し、他の成分の干渉を減らし、細胞を損傷しないように注意してください。 （5）細胞サンプルの収集は、十分な細胞濃度を確保する必要があります。すなわち、1×10 6細胞/ ml、不純物、破片、塊および重複細胞は2％未満であり、腫瘍細胞DNA異数体のサンプルの少なくとも20％を分析する必要があります。腫瘍細胞が存在します。 （6）パラフィン包埋組織の単一細胞を調製する場合、自己分解および壊死を伴わない組織の選択に注意を払う必要があります。腫瘍組織標本については、腫瘍細胞を含む領域を選択します。 40から50μm。 薄すぎるスライスまたは厚すぎるスライスは、テスト結果に影響を与えます;残留パラフィンが酵素の消化活性に影響を与えるのを防ぐために徹底的に脱ろうキシレンを廃棄し、100％エタノールを加えて脱ろうが完了したことを確認します。浮き上がり、ワックスが除去されたことを示します。水分補給は組織を新鮮な組織に似た状態に戻すのに十分です。消化時間と消化酵素の活性に注意してください。 0.5％ペプシン、pH 1.5を日常的に使用しました。 （3）運用面 （1）フローサイトメーターは作業プロセス全体を通して最適な状態にあり、定量的検出の精度と精度を保証できます。 標準サンプルを使用して機器の変動係数を最小範囲に調整すると、分解能は最適な状態になり、測定プロセス中の機器条件の変化によって検出エラーが発生するのを防ぎます。 （2）機器の精度を評価するための重要な指標は、機器の変動係数（CV）です。校正サンプルの場合、CV値が小さいほど、CV値は小さくなり、機器校正の精度が高いことを示します。 キャリブレーションサンプルには、非生体サンプル（蛍光ミクロスフェア）および生体細胞サンプル（ヒトリンパ球、ニワトリ赤血球など）が含まれます。 現在、非生物発光ミクロスフェアには市販の試薬があり、CVは一般に<2％から3％です。 （4）データ分析 （1）サンプル内のデブリまたは凝集塊が多すぎる場合、測定された細胞の数は20％未満であり、ヒストグラムのベースラインは放棄されるべきです。 （2）細胞周期分析を実行する場合、サンプル細胞の数は、破片、不純物、および凝集体を除いて10,000であるべきです。異数性細胞の数が細胞の総数の10％未満を占める場合、他の診断指標を組み合わせる必要があります。結論として、少なくとも異数体細胞が細胞総数の20％以上を占めており、異数体の存在を判定することができます。 （3）DNA分析では、正常な2倍体細胞群のCV値が8％を超えると分析は中止されましたが、腫瘍細胞のCV値は8％を超えており、これは腫瘍細胞の不均一性に関連していました。 さらに、DNA倍数性分析では、相同組織の個体の10％がドリフトします。 （4）DNA倍数性標準の品質管理、同じ個々の相同正常組織、同じ固定方法、同じサンプル処理方法、同じ染色方法、同時染色、同じ機器検出条件、通常の二倍体組織を使用して内部標準。 検査プロセス フローサイトメトリー分析：胸膜液中の細胞を蛍光色素（ヨウ化プロピジウムなど）で直接染色し、胸膜液細胞のDNA含有量、細胞周期分布、DNA倍数性をフローサイトメトリーで分析しました。 フローサイトメトリーによる定期検査のサンプル準備： （1）直接免疫蛍光標識 一定量の細胞（約1X106細胞/ ml）を取り、免疫標識反応用のフルオレセイン結合抗体を直接追加します（二重標識または多重標識染色など、異なるフルオレセインで標識されたいくつかの抗体を同時に追加します）、インキュベートします20〜60分後、PBS（pH 7.2〜7.4）で1〜2回洗浄し、バッファーに再懸濁して、マシンでテストします。 この方法には、簡単な操作、正確な結果、簡単な分析という利点があり、同じ細胞グループの複数のパラメーターを同時に決定するのに適しています。 直接標識抗体試薬のコストは高くなりますが、間接標識法での強い非特異的蛍光の干渉が減少するため、臨床検体の検出により適しています。 （2）間接免疫蛍光標識 一定量の細胞懸濁液（約1X106細胞/ ml）を取り、最初に特定の一次抗体を加え、反応が完了した後、未結合抗体を洗浄し、次に蛍光標識二次抗体を加えて抗原抗体抗体複合体を形成しますFCMは、標識されたフルオレセインが励起された後に放出される蛍光を検出します。 この方法は低コストであり、二次抗体は広く使用されており、主に科学標本の検出に使用されています。 ただし、二次抗体は一般にポリクローナル抗体であるため、特異性が低く、非特異的な蛍光バックグラウンドが強いため、実験結果に影響を与えやすくなります。 したがって、陰性対照または陽性対照を検体の調製に追加する必要があります。 さらに、標準的なラベリング法のステップ数が多いため、細胞の損失が増加し、少数の細胞で検体を測定するのには適していません。 群衆に適していない いや