Analiza DNA metodą cytometrii przepływowej

Cytometria przepływowa DNA jest metodą badania, która może badać komórki międzyfazowe i nie wpływa na nią stan proliferacji komórek, i jest ważna dla wykrywania komórek złośliwych w wysięku opłucnowym. Zakres wykrywania cytometrii przepływowej: 1. Cytometria przepływowa może wykryć strukturę komórki, w tym rozmiar komórki, rozmiar komórki, powierzchnię komórki, stosunek nukleoplazmatyczny, zawartość DNA i cykl komórkowy, zawartość RNA, zawartość białka. 2. Cytometria przepływowa może wykrywać funkcje komórkowe, w tym antygeny powierzchniowe / cytoplazmatyczne / jądrowe, aktywność komórkową, cytokiny wewnątrzkomórkowe, aktywność enzymatyczną, miejsca wiązania hormonów i receptory komórkowe. Podstawowe informacje Klasyfikacja specjalistyczna: klasyfikacja badań sercowo-naczyniowych: badanie krwi Obowiązująca płeć: czy mężczyźni i kobiety stosują post: nie na czczo Wskazówki: zachowaj normalny sposób myślenia. Wartość normalna Ciało jest w dynamicznej równowadze bez chorób. Znaczenie kliniczne Zastosowanie kliniczne cytometrii przepływowej: 1. Zastosowanie cytometrii przepływowej w onkologii Cytometria przepływowa może wykryć cykl proliferacji komórek nowotworowych, wykryć markery powierzchni komórek nowotworowych, produkty ekspresji onkogenu, przeprowadzić analizę oporności wielolekowej i wykryć apoptozę; 2. Zastosowanie cytometrii przepływowej w hematologii do wykrywania białaczki i komórek chłoniaka, aktywowanych płytek krwi, liczby hematopoetycznych komórek macierzystych (CD34 +), immunofenotypowania białaczek i chłoniaków, liczby retikulocytów, krzyżowego przeszczepu komórek oraz Monitorowanie stanu odporności; 3. Cytometria przepływowa w immunologii może być stosowana do analizy limfocytów i ich podgrup, immunofenotypowania limfocytów, wykrywania cytokin. Nieprawidłowe wyniki Istnieją dane dotyczące analizy cytometrii przepływowej 71 przypadków wysięku opłucnej Wyniki wykazały, że czułość złośliwego wysięku opłucnowego wynosiła 52%, a swoistość wynosiła 100%. W połączeniu z rutynowymi testami czułość diagnozy może wynosić nawet 94%. Analiza DNA rakowych komórek wysiękowych opłucnej wykazała wzrost odsetka komórek aneuploidalnych i fazy S, w fazie G2 / M. Osoby, które należy zbadać, są podejrzane o rakowy wysięk opłucnowy i inne powiązane choroby. Środki ostrożności Cytometria przepływowa nie jest w pełni zautomatyzowanym instrumentem. Dokładne wyniki eksperymentów wymagają dokładnych technik manualnych, dlatego przygotowanie próbek wymaga specyfikacji, a sam instrument wymaga kontroli jakości. (1) Czynniki wpływające i kontrola jakości wykrywania immunologicznego metodą cytometrii przepływowej Cytometria przepływowa ma szeroki zakres zastosowań w immunologii Przygotowanie preparatów do barwienia immunofluorescencyjnego jest bardzo ważne, często ze względu na występowanie antropogenicznej niespecyficznej interferencji fluorescencji (szczególnie w pośrednim barwieniu immunofluorescencyjnym) lub niskie stężenie komórek podczas przygotowywania próbki. Wyniki testu Rozwiązania tych wpływających czynników są następujące: (1) Upewnij się, że stężenie próbki przed wykryciem maszyny wynosi 1X106 komórek / ml, a stężenie komórek jest zbyt niskie, co bezpośrednio wpływa na wynik wykrywania. (2) Zastosowanie białkowych środków blokujących do blokowania niespecyficznych miejsc wiązania jest szczególnie konieczne do pośredniego znakowania immunofluorescencyjnego. Powszechnie stosowanymi środkami blokującymi białka są 0,5% albumina surowicy bydlęcej i 1% płodowa surowica bydlęca. (3) Przeciwciało fluorescencyjne jest dokładnie płukane po barwieniu, należy zwrócić uwagę na szybkość mieszania i wirowania oraz zmniejszyć nakładające się komórki i resztki komórek. (4) Próbkę kontrolną przygotowano przy użyciu kontroli tła niespokrewnionych kontroli i fluorescencyjnych przeciwciał, które pasowały do ​​tego samego źródła przeciwciała. (5) Oceniając wynik, należy zwrócić uwagę na odejmowanie fluorescencji tła W celu dokładniejszej analizy ilościowej immunofluorescencji stosuje się oprogramowanie komputerowe do odejmowania piku krzywej grupy kontrolnej od piku krzywej grupy eksperymentalnej metodą dopasowania krzywej. Można uzyskać dokładniejsze wyniki ilościowe immunofluorescencji. (6) Zwróć uwagę na unikanie światła po barwieniu, aby zapewnić stabilność immunofluorescencji komórkowej. (2) Nadal nie ma jednolitego standardu kontroli jakości analizy ploidalnej DNA. Wyniki eksperymentów przedstawione w różnych literaturach są zupełnie inne. W październiku 1993 r. Amerykańska Organizacja Badań nad Rakiem opracowała jednolity standard oznaczania DNA FCM, który połączyliśmy zgodnie z tymi standardami. Doświadczeni eksperci od wielu lat praktykują wyjaśnianie kontroli jakości i środków ostrożności technologii analizy DNA FCM. (1) W przypadku pobierania świeżych próbek do chirurgicznej resekcji lub igieł do biopsji należy unikać krwotocznej martwiczej tkanki. (2) Próbki powinny zostać utrwalone lub zamrożone w czasie po pobraniu, aby uniknąć autolizy i degradacji DNA, co prowadzi do błędów w wynikach badań. (3) Utrwalacz powinien przyjąć stężenie silnie penetrujące do komórek tkankowych, a 70% etanolu jest lepsze. (4) Podczas przygotowania zawiesiny jednokomórkowej należy oddzielić składniki badanych komórek, zmniejszyć interferencję innych składników i uważać, aby nie uszkodzić komórek. (5) Pobranie próbek komórek powinno zapewnić wystarczające stężenie komórek, tj. 1 x 106 komórek / ml, zanieczyszczenia, zanieczyszczenia, grudki i nakładające się komórki powinny wynosić <2%, a co najmniej 20% próbek aneuploidów DNA komórek nowotworowych powinno zostać przeanalizowane. Komórki nowotworowe są obecne. (6) Przygotowując pojedynczą komórkę tkanki zatopionej w parafinie, należy zwrócić uwagę na wybór tkanki bez autolizy i martwicy. W przypadku próbki tkanki nowotworowej wybiera się obszar zawierający komórki nowotworowe; najlepiej powinna być odpowiednia grubość arkusza tkanki parafinowej, najlepiej 40 do 50 μm. Zbyt cienkie lub zbyt grube plastry wpłyną na wyniki testu; dokładnie odparafinowane, aby zapobiec wpływaniu resztkowej parafiny na aktywność trawienną enzymu. Sprawdź, czy odparafinowanie jest zakończone przez usunięcie ksylenu i dodanie 100% etanolu. Pływający, wskazujący, że wosk został usunięty; nawodnienie jest wystarczające, aby przywrócić tkankę do stanu podobnego do świeżej tkanki; zwróć uwagę na czas trawienia i aktywność enzymów trawiennych. Rutynowo stosowano 0,5% pepsyny, pH 1,5. (3) Aspekty operacyjne (1) Cytometr przepływowy znajduje się w optymalnym stanie podczas całego procesu roboczego, co może zapewnić dokładność i dokładność wykrywania ilościowego. Wykorzystując próbkę standardową do dostosowania współczynnika zmienności przyrządu do minimalnego zakresu, rozdzielczość jest w najlepszym stanie, aby uniknąć błędów wykrywania spowodowanych zmianami warunków przyrządu podczas procesu pomiaru. (2) Ważnym wskaźnikiem do oceny dokładności przyrządu jest współczynnik zmienności (CV) przyrządu. W przypadku próbki kalibracyjnej, im mniejsza jest wartość CV, tym mniejsza jest wartość CV, wskazując, że dokładność kalibracji przyrządu jest wyższa. Próbki kalibracyjne obejmują próbki niebiologiczne (fluorescencyjne mikrosfery) i próbki komórek biologicznych (ludzkie limfocyty, czerwone krwinki kurze itp.). Obecnie mikrosfery niebiololuminescencyjne mają komercyjne odczynniki, a CV wynosi zwykle <2% do 3%. (4) Analiza danych (1) Gdy w próbce znajduje się zbyt dużo gruzu lub aglomeratów, liczba zmierzonych komórek wynosi poniżej 20% i należy zrezygnować z linii podstawowej histogramu. (2) Podczas przeprowadzania analizy cyklu komórkowego liczba komórek próbki powinna wynosić 10 000, z wyłączeniem gruzu, zanieczyszczeń i aglomeratów. Gdy liczba komórek aneuploidalnych stanowi mniej niż 10% całkowitej liczby komórek, konieczne jest połączenie innych wskaźników diagnostycznych. Podsumowując, przynajmniej komórki aneuploidalne stanowią ponad 20% całkowitej liczby komórek i można określić obecność aneuploidów. (3) W analizie DNA analizę zaniechano, gdy wartość CV normalnej diploidalnej grupy komórek wynosiła> 8%, ale wartość CV komórek nowotworowych wynosiła> 8%, co było związane z niejednorodnością komórek nowotworowych. Ponadto, w analizie ploidalnej DNA, 10% osobników w tkance homologicznej dryfuje. (4) Kontrola jakości standardów ploidalnych DNA, przy użyciu tej samej indywidualnej homologicznej tkanki normalnej, tej samej metody utrwalania, tej samej metody przetwarzania próbki, tej samej metody barwienia, jednoczesnego barwienia, takich samych warunków wykrywania instrumentu, normalnej tkanki diploidalnej jak Standard wewnętrzny. Proces kontroli Analiza cytometrii przepływowej: komórki w płynie opłucnowym zostały bezpośrednio zabarwione barwnikami fluorescencyjnymi (takimi jak jodek propidyny), a zawartość DNA, rozkład cyklu komórkowego i ploidalność komórek płynu opłucnowego analizowano metodą cytometrii przepływowej. Przygotowanie próbki do rutynowych badań metodą cytometrii przepływowej: (1) Bezpośrednie znakowanie immunofluorescencyjne Weź pewną ilość komórek (około 1 x 106 komórek / ml), dodaj bezpośrednio przeciwciało skoniugowane z fluoresceiną do reakcji znakowania immunologicznego (takie jak barwienie podwójnie znakowane lub znakowane wielokrotnie, dodaj kilka przeciwciał znakowanych inną fluoresceiną jednocześnie), inkubuj Po 20 do 60 minut, przemyj PBS (pH 7,2 do 7,4) 1 lub 2 razy, ponownie zawieszaj w buforze i testuj na maszynie. Ta metoda ma zalety prostej operacji, dokładnego wyniku i łatwej analizy i nadaje się do jednoczesnego określania wielu parametrów tej samej grupy komórek. Chociaż koszt bezpośrednio znakowanego odczynnika przeciwciała jest wysoki, zmniejsza interferencję silnej niespecyficznej fluorescencji w metodzie znakowania pośredniego, a zatem jest bardziej odpowiedni do wykrywania próbek klinicznych. (dwa) pośrednie znakowanie immunofluorescencyjne Weź pewną ilość zawiesiny komórkowej (około 1 x 106 komórek / ml), najpierw dodaj specyficzne pierwsze przeciwciało, przemyj niezwiązane przeciwciało po zakończeniu reakcji, a następnie dodaj fluorescencyjnie znakowane wtórne przeciwciało, aby utworzyć kompleks antygen-przeciwciało-przeciwciało FCM wykrywa fluorescencję emitowaną przez znakowaną fluoresceinę po wzbudzeniu. Metoda ta jest tania, a wtórne przeciwciało jest szeroko stosowane i jest najczęściej stosowane do wykrywania próbek naukowych. Ponieważ jednak wtórne przeciwciało jest zasadniczo przeciwciałem poliklonalnym, swoistość jest niska, a niespecyficzne tło fluorescencyjne jest silne, co z łatwością wpływa na wyniki eksperymentu. Dlatego do przygotowania próbki należy dodać kontrolę negatywną lub pozytywną. Ponadto, ze względu na dużą liczbę etapów w standardowej metodzie znakowania, utrata komórek jest zwiększona i nie jest odpowiedni pomiar próbek z małą liczbą komórek. Nie nadaje się dla tłumu Nie