Immunologiczne wykrywanie Helicobacter pylori

Testy immunologiczne Helicobacter pylori wykrywają zakażenie H. pylori poprzez pomiar przeciwciał Helicobacter pylori w surowicy, w tym testy pasywnej hemaglutynacji, techniki immunoblottingu i testy immunoenzymatyczne (ELISA). Pacjent wziął płyn mózgowo-rdzeniowy i rozcieńczał antygen 96-studzienkową płytką do hemaglutynacji typu V w celu rozcieńczenia antygenu JE, tak aby każda studzienka zawierała 25 ul, a badana surowica była rozcieńczana 1:10 z każdym rozcieńczeniem. Dodaj 25 ul, dodaj liofilizowane japońskie przeciwciało monoklonalne w mózgu, aby uwrażliwić owcze czerwone krwinki na 25 ul i obserwuj wyniki po odstaniu w 37 ° C przez kilka godzin. Podstawowe informacje Klasyfikacja specjalistyczna: klasyfikacja badań wzrostu i rozwoju: badanie krwi Obowiązująca płeć: czy mężczyźni i kobiety stosują post: post Wskazówki: Trzymaj pusty żołądek z egzaminu. Wartość normalna Wynik był negatywny. Znaczenie kliniczne Nieprawidłowe wyniki: 1. Miano aglutynacji surowicy w teście jest 4 razy lub ponad 4 razy wyższe niż kontrola antygenu. Miano antygenu w surowicy podczas okresu rekonwalescencji było 4 lub więcej razy wyższe niż faza ostra i było dodatnie. 2. Istnieje specjalna reakcja barwna, która dowodzi, że istnieje pewne białko. 3. Stosunek badanej surowicy do znanej surowicy ujemnej (P / N) ≥ 2,1, a wartość OD badanej surowicy wynosi ≥ 0,4, następnie ocenia się ją jako dodatnią. Trzeba sprawdzić tłum: pacjenci z chorobą wrzodową. Środki ostrożności Przeciwwskazania przed inspekcją: Zwróć uwagę na ochronę mózgu; przygotuj różne płyny opakowaniowe i skonfiguruj stężenie. Tabu podczas sprawdzania: 1. Pacjent bierze płyn mózgowo-rdzeniowy, aby siedzieć, aby nie zranić głowy. 2. Przeciwciała monoklonalne stosowane w celu uwrażliwienia owiec na czerwone krwinki, które mają być liofilizowane przed użyciem. 3. Rozcieńczenie, czas działania i temperatura pierwotnych i wtórnych przeciwciał powinny być wstępnie eksperymentowane w celu określenia optymalnych warunków dla różnych białek. 4. Roztwór wywołujący kolor musi być świeżo skonfigurowany i ostatecznie dodany do H2O2. 5. DAB może powodować raka, dlatego należy zachować ostrożność podczas jego obsługi. 6. Ściśle kontrolne czynniki wpływające na skuteczność znakowania, takie jak temperatura, czas, pH, enzym i ilość przeciwciał. 7. Podczas instalowania kolumny ujednolic ją, powierzchnia cylindra będzie płaska i nie będzie żadnych pęcherzyków ani pęknięć. Proces kontroli Po pierwsze, pasywne krzepnięcie krwi Pacjent wziął płyn mózgowo-rdzeniowy i rozcieńczał antygen 96-studzienkową płytką do hemaglutynacji typu V w celu rozcieńczenia antygenu JE, tak aby każda studzienka zawierała 25 ul, a badana surowica była rozcieńczana 1:10 z każdym rozcieńczeniem. Dodaj 25 µl i dodaj 25 µl uwrażliwionych owiec czerwonych krwinek przez liofilizowane japońskie przeciwciało monoklonalne w mózgu i obserwuj wyniki po odstaniu w 37 ° C przez kilka godzin. Po drugie, technologia immunoblottingu (A) otrzymana próbka białka: po bakteryjnej indukcji ekspresji komórki można bezpośrednio lizować przez bufor ładujący do elektroforezy, komórki eukariotyczne plus bufor do homogenizacji, homogenat mechaniczny lub ultradźwiękowy w temperaturze pokojowej 0,5-1 min. Następnie wirowano przy 13 000 g przez 15 minut w 4 ° C. Weź supernatant jako próbkę. (2) Elektroforeza: Żel elektroforezy został przygotowany i poddany SDS-PAGE. (3) Transfer: (transfer półsuchy) 1. Po zakończeniu elektroforezy, przyciąć pasek do odpowiedniego rozmiaru i zrównoważyć buforem membranowym, 5 min x 3 razy. 2. Obróbka membranowa: bibułę filtracyjną i membranę NC tego samego rozmiaru co pasek wstępnie pocięto i zanurzono w buforze do przenoszenia na 10 minut. 3. Folia transferowa: Urządzenie do transferu folii jest umieszczane w kolejności od dołu do góry zgodnie z kolejnością płytki anodowej, 24 warstw bibuły filtracyjnej, folii NC, żelu, 24 warstw bibuły filtracyjnej i płytki węglowej z katodą. Pęcherzyki usunięto w jednym etapie i nałożono na nie ciężar 500 g, aby wysuszyć nadmiar płynu na płycie węglowej. Włącz zasilanie, prąd stały 1mA / cm2, transfer 1,5 godziny. Po zakończeniu transferu moc jest usuwana, membrana jest wyjmowana, a testowany pasek jest cięty pod kątem immunoblottingu. Standardowe paski białkowe wybarwiano, umieszczano w roztworze barwiącym membrany na 50 s, a następnie kilkakrotnie odbarwiono w 50% metanolu do przezroczystego tła, następnie przemyto dwukrotnie wodą destylowaną, wysuszono na powietrzu w dwóch warstwach bibuły filtracyjnej i pozostawiono do barwienia Wyniki są porównywane. (4) Odpowiedź immunologiczna: 1. Przemyć membranę 0,01 M PBS przez 5 minut x 3 razy. 2. Dodaj roztwór do powlekania i delikatnie wstrząśnij w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. 3. Odrzucić roztwór i przemyć membranę 0,01 M PBS przez 5 minut × 3 razy. 4. Dodaj pierwotne przeciwciało (rozcieńczone 0,01 M PBS w odpowiednim stosunku rozcieńczenia, ciecz musi pokryć całą membranę) i pozostawić w 4 ° C na dłużej niż 12 godzin. W kontroli negatywnej pierwotne przeciwciało zastąpiono 1% BSA, a pozostałe etapy były takie same jak w grupie eksperymentalnej. 5. Odrzucić pierwotne przeciwciało i 1% BSA i przemyć membranę 0,01 M PBS, 5 min. × 4 razy. 6. Dodaj drugie przeciwciało sprzężone z peroksydazą chrzanową (rozcieńczone 0,01 M PBS przy odpowiednim stosunku rozcieńczenia) i delikatnie wstrząsaj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. 7. Odrzucić wtórne przeciwciało i przemyć membranę 0,01 M PBS przez 5 min x 4 razy. 8. Dodaj roztwór barwiący, unikaj światła i rozwijaj kolor, aż pojawi się prążek. Dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby zatrzymać reakcję. Po trzecie, oznaczanie adsorpcji enzymatycznej Powszechnie stosowane metody ELISA obejmują metodę kanapkową z podwójnym przeciwciałem i metodę pośrednią, pierwszą do wykrywania antygenów makrocząsteczkowych, a drugą do pomiaru swoistych przeciwciał. Pośredni test ELISA Ta metoda jest stosowana głównie do wykrywania przeciwciał. Procedura pośredniego testu ELISA jest następująca. (1) Materiały 1 płyn powlekający, płyn myjący, płyn utrwalający ciepło, płyn substratowy i płyn zatrzymujący; Antygen powlekany 2DVH, znakowane enzymatycznie przeciwciało, ujemna i dodatnia surowica referencyjna DVH; 3 detektor ELISA, próbnik, mikropłytka polistyrenowa. (2) Kroki metody 1 plus powłoka antygenowa → 4 ° C przez noc, myte trzy razy, wyrzucić do sucha; 2 plus surowica do przetestowania → 37 ° C przez 2 godziny, trzykrotnie przemyte, wysuszyć; 3 plus przeciwciało znakowane enzymem → 37 ° C przez 2 godziny, trzykrotnie przemyte, wysuszyć; 4 dodać roztwór substratu → 37 ° C przez 30 minut, dodać roztwór zatrzymujący; 5 Wartość OD zmierzono za pomocą detektora ELISA i obliczono stosunek P / N. 2. Kanapkowy test ELISA z podwójnym przeciwciałem Ta metoda jest stosowana głównie do wykrywania antygenów makrocząsteczkowych. 1 plus powłoka przeciwciał → 4 ° C przez noc, przemywana trzykrotnie, suszona; 2 plus testowany antygen → 37 ° C przez 30 minut, trzykrotnie przemyte, wysuszyć; 3 plus przeciwciało znakowane enzymem → 37 ° C przez 30 minut, trzykrotnie przemyte, wysuszyć; 4 dodać roztwór substratu → 37 ° C przez 15 minut, dodać roztwór zatrzymujący; 5 Wartość OD została zmierzona za pomocą testera ELISA. Nie nadaje się dla tłumu Nie nadaje się do sprawdzania tłumu: brak. Działania niepożądane i ryzyko Brak powiązanych komplikacji lub zagrożeń.