Western blotting

Imunotransferência é a transferência de proteínas para uma membrana e subsequente detecção utilizando anticorpos. Para a prote�a expressa conhecida, o anticorpo correspondente pode ser utilizado como o anticorpo prim�io para detec�o O produto de express� do novo gene pode ser detectado pela parte de fus� do anticorpo e tem as vantagens de grande capacidade anal�ica, alta sensibilidade, forte especificidade, etc. Um dos métodos mais comumente usados ​​de expressão e distribuição, tais como detecção qualitativa e quantitativa de antígenos de tecido, determinação de massa de moléculas polipeptídicas e detecção de anticorpos ou antígenos de vírus. Informação básica Classificação especializada: classificação de verificação de crescimento e desenvolvimento: exame bioquímico Sexo aplicável: se homens e mulheres aplicam jejum: não jejuar Dicas: Obedeça as instruções do médico. Valor normal Nenhuma reação de cor especial. Significado clínico Resultados anormais: Há uma reação de cor especial, que prova que existe uma certa proteína. Precisa verificar a multidão: verifique se há uma determinada proteína. Precauções Tabu ao verificar: Nenhum. Tabu ao verificar: 1. A diluição, o tempo de ação e a temperatura do anticorpo primário e do anticorpo secundário são determinados pela pré-experiência para determinar as condições ótimas para diferentes proteínas. 2. A solução de revelação de cor deve ser recém-configurada e usada e finalmente H2O2 é adicionado. 3, DAB tem o potencial de carcinogenicidade, tenha cuidado ao manusear. Processo de inspeção (A) amostra de prote�a obtida: ap� indu�o bacteriana de express�, as c�ulas podem ser directamente lisadas por tamp� de carga de electroforese, c�ulas eucari�icas mais tamp� de homogeneiza�o, homogeneizado de temperatura ambiente ultra-s�ico ou mec�ico 0,5-1 min. Foi ent centrifugado a 13.000 g durante 15 min a 4. Tome o sobrenadante como uma amostra. (2) Electroforese: Preparou-se um gel de electroforese e submeteu-se a SDS-PAGE. (3) Transferência: (transferência semi-seca) 1. Após a eletroforese terminar, corte a tira no tamanho apropriado e equilibre com o tampão da membrana, 5 min × 3 vezes. 2. Tratamento da membrana: O papel de filtro e a membrana NC do mesmo tamanho da tira foram pré-cortados e imersos no tampão de transferência durante 10 min. 3. Película de transferência: O dispositivo de transferência de filme é colocado em ordem de baixo para cima de acordo com a ordem da placa de carbono do anodo, 24 camadas de papel de filtro, filme NC, gel, 24 camadas de papel de filtro e placa de carbono catódico. As bolhas foram removidas num passo, e foi aplicado um peso de 500 g para secar o excesso de líquido na placa de carbono. Ligue o poder, corrente constante 1mA / cm2, transferência de 1.5hr. Após a conclusão da transferência, a energia é removida e a membrana é removida, e a tira a ser testada é cortada para immunoblotting. As tiras padrão de proteína foram coradas, colocadas na solução de coloração da membrana por 50 s, e depois descoloradas em 50% metanol várias vezes em um fundo claro, depois lavadas com água bidestilada, secas ao ar em duas camadas de papel de filtro e deixadas para colorir Os resultados são comparados. (4) resposta imune: 1. Lave a membrana com PBS a 0,01 M durante 5 min x 3 vezes. 2. Adicione a solução de revestimento e agite suavemente à temperatura ambiente por 2 horas. 3. Descarte a solução e lave a membrana com PBS 0,01 M por 5 min × 3 vezes. 4. Adicione o anticorpo primário (diluído com 0,01 M PBS em uma razão de diluição adequada, o líquido deve cobrir toda a membrana), e deixe a 4 ° C por mais de 12 horas. No controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído por BSA a 1% e os restantes passos foram os mesmos que no grupo experimental. 5. Elimine o anticorpo primário e 1% de BSA e lave a membrana com 0,01 M de PBS, 5 min × 4 vezes. 6. Adicione o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (diluído com 0,01 M PBS na razão de diluição apropriada) e agite suavemente durante 2 horas à temperatura ambiente. 7. Descartar o anticorpo secundário e lavar a membrana com PBS 0,01 M por 5 min × 4 vezes. 8. Adicione a solução de coloração, evite a luz e desenvolva a cor até que a faixa apareça, coloque a água bidestilada para interromper a reação. Não é adequado para a multidão Não é adequado para a multidão: não. Reações adversas e riscos Sem complicações ou riscos relacionados.