Flödescytometrisk DNA-analys

Flödescytometrisk DNA-analys är en undersökningsmetod som kan studera intervallceller och påverkas inte av tillståndet av cellproliferation, och är viktigt för att upptäcka maligna celler i pleural effusion. Flödescytometri-detekteringsintervall: 1. Flödescytometri kan detektera cellstruktur, inklusive cellstorlek, cellstorlek, cellyta, nukleoplasmatförhållande, DNA-innehåll och cellcykel, RNA-innehåll, proteininnehåll. 2. Flödescytometri kan detektera cellfunktioner, inklusive cellytan / cytoplasmatiska / kärnspecifika antigener, cellulära aktiviteter, intracellulära cytokiner, enzymaktiviteter, hormonbindningsställen och cellulära receptorer. Grundläggande information Specialklassificering: klassificering av kardiovaskulär undersökning: blodundersökning Tillämpligt kön: om män och kvinnor tillämpar fasta: inte fasta Tips: Håll ett normalt tankesätt. Normalt värde Kroppen är i en dynamisk balans utan sjukdom. Klinisk betydelse Klinisk tillämpning av flödescytometri: 1. Tillämpning av flödescytometri i onkologi Flödescytometri kan upptäcka tumörcellproliferationscykel, upptäcka tumörcellsytmarkörer, onkogenuttrycksprodukter, genomföra multidrug-resistensanalys och upptäcka apoptos; 2. Användning av flödescytometri i hematologi för att upptäcka leukemi och lymfomceller, aktiverade blodplättar, hematopoietisk stamcell (CD34 +), immunofenotypning av leukemi och lymfom, retikulocytantal, korsmatchning av celltransplantation och Immunstatusövervakning; 3. Flödescytometri i immunologi kan användas för lymfocyt och dess undergruppsanalys, lymfocytimmunofenotypning, detektion av cytokiner. Onormala resultat Det fanns data om flödescytometri-analys av 71 fall av pleural effusion.Resultaten visade att känsligheten för malign pleural effusion var 52% och specificiteten var 100%. Om den används i samband med rutinmässiga tester kan diagnosens känslighet vara så hög som 94%. DNA-analys av cancerösa pleurala effusionsceller visade en ökning av andelen aneuploid- och S-fas, G2 / M-fasceller. Människor som behöver undersökas misstänks ha cancer i pleural effusion och andra relaterade sjukdomar. försiktighetsåtgärder Flödescytometri är inte ett helt automatiserat instrument. Exakta experimentella resultat kräver exakta manuella tekniker. Därför kräver provberedning specifikation och själva instrumentet kräver kvalitetskontroll. (1) Påverkande faktorer och kvalitetskontroll av immunologiskt detektion med flödescytometri Flödescytometri har ett brett spektrum av tillämpningar inom immunologi. Beredningen av immunfluorescerande färgningsprover är mycket viktigt, ofta på grund av förekomsten av antropogen icke-specifik fluorescensstörning (särskilt vid indirekt färgning av immunofluorescens) eller låg cellkoncentration under provberedning. Testresultat. Lösningarna på dessa påverkande faktorer är följande: (1) Se till att koncentrationen av provet innan maskinen upptäcks är 1X106 celler / ml och att cellkoncentrationen är för låg, vilket direkt påverkar detekteringsresultatet. (2) Användning av proteinblockerande medel för att blockera icke-specifika bindningsställen är särskilt nödvändigt för indirekt märkning av immunofluorescens. Vanligt använda proteinblockerande medel är 0,5% bovint serumalbumin och 1% fetalt bovint serum. (3) Fluorescerande antikropp tvättas noggrant efter färgning, uppmärksamma blandnings- och centrifugeringshastighet och minska överlappande celler och cellskräp. (4) Ett kontrollprov upprättades med användning av en bakgrundskontroll av icke-relaterad kontroll och fluorescerande antikroppar som matchade samma antikroppskälla. (5) Vid bedömning av resultatet bör man uppmärksamma att subtrahera bakgrundens fluorescens. För att göra den kvantitativa analysen av immunofluorescens mer exakt används datorprogramvaran för att subtrahera kurvtoppen för kontrollgruppen från kurvtoppen för den experimentella gruppen med anpassningskurvan. Mer exakta kvantitativa immunofluorescensresultat kan erhållas. (6) Var uppmärksam på att undvika ljus efter färgning för att säkerställa stabiliteten i cellulär immunofluorescens. (2) Det finns fortfarande ingen enhetlig standard för kvalitetskontroll av DNA-ploidyanalys. Experimentella resultat rapporterade i olika litteraturer är ganska olika. I oktober 1993 utvecklade American Cancer Research Organization en enhetlig standard för bestämning av FCM-DNA, som vi kombinerade enligt dessa standarder. Erfaren experter har övat i många år för att förklara kvalitetskontroll och försiktighetsåtgärder för FCM: s DNA-analysteknik. (1) När färska prover för kirurgisk resektion eller biopsi-nålar tas, bör den hemorragiska nekrotiska vävnaden undvikas. (2) Prover bör fixeras eller kryokonserveras i tid efter insamling för att undvika autolys och nedbrytning av DNA, vilket resulterar i fel i testresultaten. (3) Fixativet bör anta en koncentration som är mycket penetrerande till vävnadscellerna och 70% av etanolen är bättre. (4) Under beredningen av encellsuspension, se till att separera komponenterna i cellerna som ska testas, minska interferensen av andra komponenter och se till att inte skada cellerna. (5) Insamling av cellprover bör säkerställa tillräcklig cellkoncentration, dvs 1 × 106 celler / ml, föroreningar, skräp, klumpar och överlappande celler bör vara <2%, och minst 20% av proverna med aneuploider med tumörcell-DNA bör analyseras. Tumörceller är närvarande. (6) Vid beredning av den enskilda cellen av paraffininbäddad vävnad bör man uppmärksamma valet av vävnad utan autolys och nekros. För tumörvävnadsprovet väljs området som innehåller tumörcellerna; tjockleken på paraffinvävnadsarket bör vara lämpligt, företrädesvis 40 till 50 um. Alltför tunna eller för tjocka skivor kommer att påverka testresultaten, noggrant avvaxas för att förhindra att resterande paraffin påverkar enzymets matsmältningsaktivitet. Kontrollera att avvaxningen är fullständig genom att kasta bort xylen och tillsätta 100% etanol. Flytande, vilket indikerar att vaxet har tagits bort; hydratisering är tillräcklig för att återställa vävnaden till ett tillstånd som liknar färsk vävnad; var uppmärksam på tiden för matsmältningen och aktiviteten hos matsmältningsenzymer. 0,5% pepsin användes rutinmässigt, pH 1,5. (3) Operativa aspekter (1) Flödescytometern är i ett optimalt tillstånd under hela arbetsprocessen, vilket kan säkerställa noggrannheten och noggrannheten för kvantitativ detektion. Med hjälp av standardprovet för att justera instrumentets variationskoefficient till minsta intervall är upplösningen i bästa läge för att undvika detekteringsfel orsakade av förändringar i instrumentförhållandena under mätprocessen. (2) Det viktiga indexet för utvärdering av instrumentets noggrannhet är instrumentets variationskoefficient (CV). För kalibreringsprovet, desto mindre CV-värdet är, desto mindre är CV-värdet, vilket indikerar att noggrannheten för instrumentkalibreringen är högre. Kalibreringsprover inkluderar icke-biologiska prover (fluorescerande mikrosfärer) och biologiska cellprover (humana lymfocyter, röda kycklingblodceller etc.). För närvarande har icke-bioluminescerande mikrosfärer kommersiella reagens, och CV är i allmänhet <2% till 3%. (4) Dataanalys (1) När det finns för många skräp eller agglomerat i provet är antalet celler uppmätt under 20% och histogrammets baslinje bör överges. (2) Vid utförande av cellcykelanalys bör antalet provceller vara 10 000, exklusive skräp, föroreningar och agglomerat. När antalet aneuploidceller står för mindre än 10% av det totala antalet celler är det nödvändigt att kombinera andra diagnostiska indikatorer. Sammanfattningsvis står minst aneuploidceller för mer än 20% av det totala antalet celler, och närvaron av aneuploider kan bestämmas. (3) Vid DNA-analysen övergavs analysen när CV-värdet för den normala diploida cellgruppen var> 8%, men CV-värdet för tumörcellerna var> 8%, vilket var relaterat till tumörcells heterogenitet. I DNA-ploidianalys kommer 10% av individerna i den homologa vävnaden att driva ut. (4) Kvalitetskontroll av DNA-ploidistandarder, med samma individuella homologa normala vävnader, samma fixeringsmetod, samma provbearbetningsmetod, samma färgningsmetod, samtidig färgning, samma instrumentdetekteringsförhållanden, normal diploid vävnad som Intern standard. Inspektionsprocess Flödescytometri-analys: celler i pleuralvätska färgades direkt med fluorescerande färgämnen (såsom propidiumjodid), och DNA-innehåll, cellcykelfördelning och DNA-plöda av pleuravätskeceller analyserades med flödescytometri. Provberedning för rutinmässig test med flödescytometri (1) Direkt immunofluorescensmärkning Ta en viss mängd celler (cirka 1X106 celler / ml), lägg direkt till den fluoresceinkonjugerade antikroppen för immunmärkningsreaktion (såsom dubbelmärkt eller flermärkt färgning, tillsätt flera antikroppar märkta med olika fluorescein på samma gång), inkubera Tvätta med PBS (pH 7,2 till 7,4) efter 20 till 60 minuter i 1 eller 2 gånger, återsuspendera i buffert och testa på maskinen. Metoden har fördelarna med enkel drift, exakt resultat och enkel analys och är lämplig för samtidig bestämning av flera parametrar i samma cellgrupp. Även om kostnaden för det direktmärkta antikroppsreagenset är högt reducerar det interferensen av stark, ospecifik fluorescens i den indirekta märkningsmetoden, och är därför mer lämpad för detektering av kliniska prover. (två) indirekt immunofluorescensmärkning Ta en viss mängd cellsuspension (cirka 1X106 celler / ml), tillsätt först en specifik första antikropp, tvätt den obundna antikroppen efter att reaktionen är klar och tillsätt sedan en fluorescerande märkt sekundär antikropp för att bilda ett antigen-antikropp-antikroppskomplex FCM detekterar fluorescensen som avges av det märkta fluoresceinet efter att det är upphetsat. Metoden har låg kostnad och den sekundära antikroppen används i stor utsträckning och används mest för att detektera vetenskapliga prover. Eftersom den sekundära antikroppen i allmänhet är en polyklonal antikropp är specificiteten dålig och den icke-specifika fluorescerande bakgrunden är stark, vilket lätt påverkar de experimentella resultaten. Därför bör en negativ eller positiv kontroll läggas till beredningen av provet. På grund av det stora antalet steg i standardmärkningsmetoden ökar dessutom förlusten av celler, och det är inte lämpligt att mäta prov med ett litet antal celler. Inte lämplig för publiken Inga.