Immunologisk detektion av Helicobacter pylori

Helicobacter pylori-immunologiska test upptäcker H. pylori-infektion genom att mäta Helicobacter pylori-antikroppar i serum, inklusive passiva hemagglutineringsanalyser, immunblottingstekniker och enzymbundna immunosorbentanalyser (ELISA). Patienten tog cerebrospinalvätskan och utspädde antigenet med hemagglutineringsplattan med 96 brunnar av V för att späda ut JE-antigenet, så att varje brunn innehöll 25 ul, och serumet som skulle testas utspäddes 1:10 med varje utspädning. Tillsätt 25 ml, tillsätt lyofiliserad japansk hjärnmonoklonal antikropp för att sensibilisera röda blodkroppar från får 25 ml och observera resultaten efter att ha stått vid 37 ° C i flera timmar. Grundläggande information Specialistklassificering: klassificering av tillväxt och utveckling: blodundersökning Tillämpligt kön: om män och kvinnor tillämpar fasta: fasta Tips: Håll tom mage från tentamen. Normalt värde Resultatet var negativt. Klinisk betydelse Onormala resultat: 1. Serumagglutinationstitern för testet är 4 gånger eller mer än 4 gånger högre än antigenkontrollen. Serumantigentiter under återhämtningsperioden var 4 eller flera gånger högre än den akuta fasen och var positiv. 2. Det finns en speciell färgreaktion, som bevisar att ett visst protein finns. 3. Förhållandet mellan serum som ska testas och det kända negativa serum (P / N) ≥ 2,1, och OD-värdet för serumet som ska testas är ≥ 0,4, då bedöms det som positivt. Behöver kontrollera publiken: patienter med magsår. försiktighetsåtgärder Kontraindikationer före inspektion: Var uppmärksam på att skydda hjärnan, förbered olika förpackningsvätskor och konfigurera koncentrationen. Tabu vid kontroll: 1. Patienten tar cerebrospinalvätskan för att sitta för att inte skada huvudet. 2. Monoklonala antikroppar som används för att sensibilisera röda blodkroppar från får som ska lyofiliseras före användning. 3. Spädning, varaktighet av verkan och temperatur för de primära och sekundära antikropparna bör förexperimenteras för att bestämma de optimala förhållandena för olika proteiner. 4. Färgutvecklingslösningen måste konfigureras nyligen och slutligen läggas till H2O2. 5. DAB har potential att orsaka cancer, så var försiktig när du hanterar den. 6. Strikt kontrollfaktorer som påverkar märkningens effektivitet såsom temperatur, tid, pH, enzym och antikroppsmängd. 7. När du installerar kolonnen, gör kolonnen enhetlig, cylinderytan är plan och det finns inga bubblor eller sprickor. Inspektionsprocess Först, passiv blodkoagulation Patienten tog cerebrospinalvätskan och utspädde antigenet med en 96-brunnars hemagglutineringsplatta av V-typ för att späda ut JE-antigenet, så att varje brunn innehöll 25 ul, och serumet som skulle testas utspäddes 1:10 med varje utspädning. Tillsätt 25 ul och tillsätt 25 ul sensibiliserade fårröda blodkroppar med lyofiliserad japansk monoklonal antikropp i hjärnan och observera resultaten efter att ha stått vid 37 ° C i flera timmar. För det andra immunblottingsteknik (A) proteinprov erhållet: efter bakteriell induktion av expression kan cellerna direkt lyseras med elektroforesbelastningsbuffert, eukaryota celler plus homogeniseringsbuffert, mekanisk eller ultraljudshastighetstemperatur homogenat 0,5-1min. Den centrifugerades sedan vid 13 000 g under 15 minuter vid 4 ° C. Ta supernatanten som ett prov. (2) Elektrofores: En elektroforesgel bereddes och utsattes för SDS-PAGE. (3) Överföring: (halvtorr överföring) 1. När elektroforesen är klar klipps remsan till lämplig storlek och jämviktas med membranbufferten, 5 min × 3 gånger. 2. Membranbehandling: Filterpapper och NC-membran av samma storlek som remsan förskärdes och nedsänktes i överföringsbufferten i 10 minuter. 3. Överföringsfilm: Filmöverföringsanordningen placeras i ordning från botten till topp enligt ordningen för anodkolplatta, 24 lager filterpapper, NC-film, gel, 24 lager filterpapper och katodkolplatta. Filterpapper, gel och NC-film är exakt i linje. Bubblorna avlägsnades i ett steg och en vikt av 500 g applicerades därpå för att torka överskottsvätskan på kolplattan. Slå på strömmen, konstant ström 1mA / cm2, överför 1,5 tim. Efter överföringen avlägsnas kraften och membranet tas ut, och remsan som ska testas skärs för immunblotting. Proteinstandardremsorna färgades, placerades i membranfärgningslösningen under 50 s och avfärgades sedan i 50% metanol flera gånger till en klar bakgrund, tvättades sedan med dubbelt destillerat vatten, lufttorkades i två lager filterpapper och lämnades att färga Resultaten jämförs. (4) Immunsvar: 1. Tvätta membranet med 0,01 M PBS i 5 minuter x 3 gånger. 2. Tillsätt beläggningslösningen och skaka försiktigt vid rumstemperatur i 2 timmar. 3. Kasta lösningen och tvätta membranet med 0,01 M PBS i 5 minuter × 3 gånger. 4. Tillsätt primär antikropp (utspädd med 0,01 M PBS i ett lämpligt utspädningsförhållande, vätskan måste täcka hela membranet) och låt stå vid 4 ° C i mer än 12 timmar. I den negativa kontrollen ersattes den primära antikroppen med 1% BSA, och de återstående stegen var desamma som i experimentgruppen. 5. Kassera den primära antikroppen och 1% BSA och tvätta membranet med 0,01 M PBS, 5 min × 4 gånger. 6. Tillsätt pepparrotsperoxidas-konjugerad sekundär antikropp (utspädd med 0,01 M PBS vid lämpligt utspädningsförhållande) och skaka försiktigt i 2 timmar vid rumstemperatur. 7. Kassera den sekundära antikroppen och tvätta membranet med 0,01 M PBS under 5 minuter × 4 gånger. 8. Tillsätt färglösningen, undvik ljuset och utveckla färg tills bandet visas. Lägg i det dubbla destillerade vattnet för att stoppa reaktionen. För det tredje, enzym kombinerad adsorptionsbestämning Vanligt använda ELISA-metoder inkluderar en dubbel antikroppssandwichmetod och en indirekt metod, den förra för att detektera makromolekylära antigener och den senare för att mäta specifika antikroppar. Indirekt ELISA Denna metod används huvudsakligen för att detektera antikroppar. Förfarandet för indirekt ELISA är som följer. (1) Material 1 beläggningsvätska, tvättvätska, värmeskyddsvätska, substratvätska och stoppvätska; 2DVH-belagt antigen, enzymmärkt antikropp, negativt och positivt DVH-referensserum; 3 ELISA-detektor, provtagare, polystyrenmikroplatta. (2) Metodsteg 1 plus antigenbeläggning → 4 ° C över natt, tvättas tre gånger, kasta torrt; 2 plus serum som ska testas → 37 ° C i 2 timmar, tvättas tre gånger, kasta torrt; 3 plus enzymmärkt antikropp → 37 ° C i 2 timmar, tvättas tre gånger, kasta torrt; 4 tillsätt substratlösning → 37 ° C i 30 minuter, tillsätt stopplösning; 5 OD-värdet mättes med en ELISA-detektor, och P / N-förhållandet beräknades. 2. ELISA med dubbel antikroppsmörgås Denna metod används huvudsakligen för att detektera makromolekylära antigener. 1 plus antikroppbeläggning → 4 ° C över natt, tvättas tre gånger, kasta torrt; 2 plus antigenet som ska testas → 37 ° C i 30 minuter, tvättas tre gånger, kasta torrt; 3 plus enzymmärkt antikropp → 37 ° C under 30 minuter, tvättas tre gånger, kasta torrt; 4 tillsätt substratlösning → 37 ° C i 15 minuter, tillsätt stopplösning; 5 OD-värdet mättes med en ELISA-testare. Inte lämplig för publiken Inte lämplig för att kontrollera publiken: ingen. Biverkningar och risker Inga relaterade komplikationer eller faror.