การวิเคราะห์ DNA แบบโฟลว์ไซโตเมทริก

Flow cytometric DNA analysis เป็นวิธีการตรวจสอบที่สามารถศึกษาเซลล์ระหว่างเฟสและไม่ได้รับผลกระทบจากสถานะของการเพิ่มจำนวนเซลล์และเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการตรวจสอบเซลล์มะเร็งในปอดไหล ช่วงการตรวจจับกระแส cytometry: 1. กระแส cytometry สามารถตรวจสอบโครงสร้างของเซลล์รวมถึงขนาดของเซลล์ขนาดเซลล์พื้นที่ผิวของเซลล์อัตราส่วนนิวคลีโอพลาสซึมปริมาณดีเอ็นเอและวัฏจักรของเซลล์ปริมาณ RNA ปริมาณโปรตีน 2. Flow cytometry สามารถตรวจจับการทำงานของเซลล์รวมถึงเซลล์ผิว / cytoplasmic / นิวเคลียร์เฉพาะแอนติเจนกิจกรรมของเซลล์ cytokines ภายในเซลล์กิจกรรมของเอนไซม์ไซต์ที่จับกับฮอร์โมนและตัวรับสัญญาณของเซลล์ ข้อมูลพื้นฐาน การจำแนกผู้เชี่ยวชาญ: การจำแนกการตรวจหัวใจและหลอดเลือด: การตรวจเลือด เพศที่ใช้บังคับ: ไม่ว่าจะเป็นผู้ชายและผู้หญิงใช้การอดอาหาร: ไม่อดอาหาร เคล็ดลับ: รักษาความคิดปกติ ค่าปกติ ร่างกายมีความสมดุลแบบไดนามิกโดยไม่มีโรค ความสำคัญทางคลินิก การประยุกต์ใช้ทางคลินิกของ flow cytometry: 1. การประยุกต์ใช้ flow cytometry ในด้านเนื้องอกวิทยา flow cytometry สามารถตรวจสอบวงจรการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็งตรวจจับพื้นผิวของตัวบ่งชี้เซลล์เนื้องอกผลิตภัณฑ์การแสดงออกของ Oncogene ดำเนินการวิเคราะห์การดื้อยาหลายชนิด 2. การประยุกต์ใช้โฟลไซโตเมทรีในโลหิตวิทยาเพื่อตรวจหามะเร็งเม็ดเลือดขาวและเซลล์มะเร็งต่อมน้ำเหลืองเกล็ดเลือดที่กระตุ้นเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (CD34 +) จำนวนการตรวจอิมมูโนฟีโนไทป์ของมะเร็งเม็ดเลือดขาวและมะเร็งต่อมน้ำเหลือง การตรวจสอบสถานะภูมิคุ้มกัน 3. โฟลไซโตเมทรีในวิทยาภูมิคุ้มกันสามารถใช้สำหรับลิมโฟไซต์และการวิเคราะห์กลุ่มย่อยอิมมูโนฟีโนไทป์ของลิมโฟไซต์และการตรวจจับไซโตไคน์ ข้อมูลผิดปกติมีข้อมูลเกี่ยวกับการวิเคราะห์ cytometry ไหลของ 71 กรณีของเยื่อหุ้มปอดไหลผลการศึกษาพบว่าความไวของปริมาตรน้ำเยื่อหุ้มปอดมะเร็งคือ 52% และความจำเพาะ 100% หากใช้ร่วมกับการทดสอบตามปกติความไวของการวินิจฉัยอาจสูงถึง 94% การวิเคราะห์ดีเอ็นเอของเซลล์มะเร็งปอดไหลพบว่าสัดส่วนของ aneuploid และ S phase, เซลล์เฟส G2 / M เพิ่มขึ้น ผู้ที่ต้องได้รับการตรวจจะสงสัยว่าเป็นมะเร็งปอดและโรคอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้อง ข้อควรระวัง Flow cytometry ไม่ใช่เครื่องมืออัตโนมัติเต็มรูปแบบผลการทดลองที่แม่นยำต้องใช้เทคนิคที่ถูกต้องด้วยตนเองดังนั้นการเตรียมชิ้นงานทดสอบจึงต้องมีข้อกำหนดและเครื่องมือเองต้องการการควบคุมคุณภาพ (1) ปัจจัยที่มีอิทธิพลและการควบคุมคุณภาพของการตรวจจับทางภูมิคุ้มกันวิทยาไหล cytometry Flow cytometry มีการใช้งานที่หลากหลายในด้านภูมิคุ้มกันวิทยาการเตรียมตัวอย่างการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์นั้นมีความสำคัญมากมักเกิดจากการแทรกแซงของการเรืองแสงที่ไม่เฉพาะเจาะจง anthropogenic (โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการย้อมอิมมูโน ผลการทดสอบ คำตอบสำหรับปัจจัยที่มีอิทธิพลเหล่านี้มีดังนี้: (1) ตรวจสอบให้แน่ใจว่าความเข้มข้นของชิ้นงานก่อนตรวจพบเครื่องคือ 1X106 เซลล์ / มล. และความเข้มข้นของเซลล์ต่ำเกินไปซึ่งส่งผลโดยตรงต่อผลการตรวจจับ (2) การใช้สารสกัดโปรตีนในการปิดกั้นเว็บไซต์ที่ไม่ผูกพันเฉพาะเป็นสิ่งจำเป็นโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการติดฉลากภูมิคุ้มกันทางอ้อม สารปิดกั้นโปรตีนที่ใช้กันทั่วไปคือ 0.5% bovine serum album และ 1% fetal bovine serum (3) แอนติบอดี้เรืองแสงจะถูกล้างอย่างทั่วถึงหลังจากการย้อมสีให้ความสนใจกับการผสมและการหมุนเหวี่ยงความเร็วและลดเซลล์ที่ทับซ้อนกันและเศษเซลล์ (4) ตัวอย่างควบคุมได้รับการตั้งค่าโดยใช้การควบคุมพื้นหลังของการควบคุมที่ไม่เกี่ยวข้องและแอนติบอดีเรืองแสงที่ตรงกับแหล่งเดียวกันของแอนติบอดี (5) เมื่อตัดสินผลควรให้ความสนใจที่จะลบฟลูออเรสเซนซ์พื้นหลังเพื่อทำการวิเคราะห์เชิงปริมาณของอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ที่แม่นยำยิ่งขึ้นโปรแกรมคอมพิวเตอร์จะถูกใช้ในการลบส่วนโค้งสูงสุดของกลุ่มควบคุม สามารถหาผลลัพธ์เชิงปริมาณอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ที่แม่นยำยิ่งขึ้น (6) ให้ความสนใจกับการหลีกเลี่ยงแสงหลังจากย้อมสีเพื่อให้แน่ใจว่าเสถียรภาพของอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์เซลล์ (2) ยังไม่มีมาตรฐานที่เป็นมาตรฐานสำหรับการควบคุมคุณภาพของการวิเคราะห์ DNA ploidy ผลการทดลองที่รายงานในวรรณคดีต่างๆนั้นค่อนข้างแตกต่างกันในเดือนตุลาคม 1993 องค์กรวิจัยโรคมะเร็งอเมริกันพัฒนามาตรฐานแบบครบวงจรสำหรับการกำหนด FCM DNA ซึ่งเรารวมเข้าด้วยกัน ผู้เชี่ยวชาญที่มีประสบการณ์ได้ฝึกฝนมาเป็นเวลาหลายปีเพื่ออธิบายการควบคุมคุณภาพและข้อควรระวังของเทคโนโลยีการวิเคราะห์ DNA ของ FCM (1) เมื่อนำตัวอย่างสดใหม่ไปใช้ในการผ่าตัดศัลยกรรมหรือการตรวจชิ้นเนื้อเข็มควรหลีกเลี่ยงเนื้อเยื่อฉีกขาดเลือดออก (2) ตัวอย่างควรได้รับการแก้ไขหรือแช่แข็งในเวลาหลังจากการเก็บเพื่อหลีกเลี่ยงการสลายตัวโดยอัตโนมัติและการสลายตัวของดีเอ็นเอทำให้เกิดข้อผิดพลาดในผลการทดสอบ (3) ตัวตรึงควรใช้ความเข้มข้นที่มีการซึมผ่านไปยังเซลล์เนื้อเยื่อสูงและ 70% ของเอทานอลจะดีกว่า (4) ในระหว่างการเตรียมสารแขวนลอยของเซลล์เดี่ยวให้ระมัดระวังในการแยกส่วนประกอบของเซลล์ที่จะทำการทดสอบลดการรบกวนของส่วนประกอบอื่น ๆ และระวังไม่ให้เกิดความเสียหายต่อเซลล์ (5) การเก็บตัวอย่างเซลล์ควรตรวจสอบให้แน่ใจว่ามีความเข้มข้นของเซลล์เพียงพอเช่น 1 × 10 6 เซลล์ / มล. สิ่งสกปรกเศษซากกอและเซลล์ที่ทับซ้อนกันควร <2% และอย่างน้อย 20% ของตัวอย่างเซลล์เนื้องอก aneuploids DNA ควรวิเคราะห์ เซลล์เนื้องอกมีอยู่ (6) เมื่อเตรียมเซลล์เดียวของเนื้อเยื่อที่ฝังพาราฟินควรให้ความสนใจกับการเลือกเนื้อเยื่อโดยไม่ต้องมีการ autolysis และการตายของเนื้อเยื่อสำหรับตัวอย่างเนื้อเยื่อเนื้องอกบริเวณที่มีเซลล์เนื้องอกจะถูกเลือกความหนาของแผ่นเนื้อเยื่อพาราฟินควรเหมาะสมกว่า 40 ถึง 50 ไมครอน ชิ้นบางหรือหนาเกินไปมากเกินไปจะส่งผลต่อผลการทดสอบ dewaxed อย่างละเอียดเพื่อป้องกันพาราฟินตกค้างที่มีผลต่อกิจกรรมย่อยอาหารของเอนไซม์ตรวจสอบว่า dewaxing เสร็จสมบูรณ์โดยการทิ้งไซลีนและเพิ่มเอทานอล 100% การลอยตัวเป็นการระบุว่าขี้ผึ้งถูกเอาออกไปแล้วไฮเดรชั่นก็เพียงพอที่จะทำให้เนื้อเยื่อกลับคืนสู่สถานะที่คล้ายกับเนื้อเยื่อสดให้ความสนใจกับเวลาของการย่อยอาหารและกิจกรรมของเอนไซม์ย่อยอาหาร ใช้เพพซิน 0.5% เป็นประจำ pH 1.5 (3) ด้านการปฏิบัติงาน (1) flow cytometer อยู่ในสภาวะที่เหมาะสมตลอดกระบวนการทำงานซึ่งสามารถรับรองความถูกต้องและแม่นยำของการตรวจจับเชิงปริมาณ การใช้ตัวอย่างมาตรฐานเพื่อปรับค่าสัมประสิทธิ์ของความแปรปรวนเป็นช่วงต่ำสุดความละเอียดอยู่ในสถานะที่ดีที่สุดเพื่อหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดในการตรวจจับที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงของสภาพเครื่องมือในระหว่างกระบวนการวัด (2) ดัชนีที่สำคัญสำหรับการประเมินความถูกต้องของเครื่องมือคือค่าสัมประสิทธิ์การแปรผัน (CV) ของเครื่องมือสำหรับตัวอย่างการสอบเทียบค่า CV ที่น้อยกว่าคือค่า CV ที่เล็กลงแสดงว่าความแม่นยำของการสอบเทียบเครื่องมือนั้นสูงกว่า ตัวอย่างการสอบเทียบรวมถึงตัวอย่างที่ไม่ใช่ชีวภาพ (microspheres เรืองแสง) และตัวอย่างเซลล์ชีวภาพ (เซลล์เม็ดเลือดขาวของมนุษย์เซลล์เม็ดเลือดแดงไก่ ฯลฯ ) ในปัจจุบัน microspheres ที่ไม่เรืองแสงมีสารรีเอเจนต์เชิงพาณิชย์และ CV โดยทั่วไป <2% ถึง 3% (4) การวิเคราะห์ข้อมูล (1) เมื่อมีเศษหรือ agglomerates มากเกินไปในตัวอย่างจำนวนเซลล์ที่วัดได้ต่ำกว่า 20% และค่าพื้นฐานของฮิสโตแกรมควรถูกยกเลิก (2) เมื่อทำการวิเคราะห์วัฏจักรของเซลล์จำนวนตัวอย่างเซลล์ควร 10,000 ไม่รวมเศษซากสิ่งสกปรกและ agglomerates เมื่อจำนวนของเซลล์ aneuploid บัญชีน้อยกว่า 10% ของจำนวนเซลล์ทั้งหมดมีความจำเป็นต้องรวมตัวบ่งชี้การวินิจฉัยอื่น ๆ โดยสรุปเซลล์ aneuploid อย่างน้อยมีสัดส่วนมากกว่า 20% ของจำนวนเซลล์ทั้งหมดและสามารถตรวจสอบสถานะของ aneuploids ได้ (3) ในการวิเคราะห์ DNA การวิเคราะห์จะถูกยกเลิกเมื่อค่า CV ของกลุ่มเซลล์ดิพลอยด์ปกติคือ> 8% แต่ค่า CV ของเซลล์มะเร็งคือ> 8% ซึ่งสัมพันธ์กับความหลากหลายของเซลล์เนื้องอก นอกจากนี้ในการวิเคราะห์ดีเอ็นเอ ploidy 10% ของบุคคลในเนื้อเยื่อคล้ายคลึงกันจะลอย (4) การควบคุมคุณภาพของมาตรฐาน DNA ploidy โดยใช้เนื้อเยื่อปกติที่มีความคล้ายคลึงกันวิธีการตรึงเดียวกันวิธีการประมวลผลตัวอย่างเดียวกันวิธีการย้อมสีเดียวกันการย้อมสีเดียวกันการย้อมสีพร้อมกันเงื่อนไขการตรวจสอบเครื่องมือเดียวกันเนื้อเยื่อซ้ำแบบปกติ มาตรฐานภายใน กระบวนการตรวจสอบ การวิเคราะห์ Flow cytometry: เซลล์ในเยื่อหุ้มปอดถูกย้อมด้วยฟลูออเรสเซนต์โดยตรง (เช่น propidium iodide) และปริมาณ DNA การกระจายวัฏจักรของเซลล์และ DNA ploidy ของเซลล์เยื่อหุ้มปอดถูกวิเคราะห์โดย flow cytometry การเตรียมตัวอย่างสำหรับการทดสอบตามปกติโดย flow cytometry: (1) การติดฉลาก immunofluorescence โดยตรง ใช้จำนวนเซลล์ (ประมาณ 1X106 เซลล์ / มล.) เพิ่มแอนติบอดี fluorescein-conjugated โดยตรงสำหรับปฏิกิริยา immunolabeling (เช่นการย้อมสีสองป้ายหรือหลายป้ายเพิ่มแอนติบอดีหลายป้ายที่มี fluorescein ที่แตกต่างกันในเวลาเดียวกัน) บ่ม หลังจาก 20 ถึง 60 นาทีล้างด้วย PBS (pH 7.2 ถึง 7.4) เป็นเวลา 1 หรือ 2 ครั้งพักในบัฟเฟอร์อีกครั้งและทดสอบบนเครื่อง วิธีนี้มีข้อดีของการใช้งานง่ายผลลัพธ์ที่ถูกต้องและการวิเคราะห์ที่ง่ายและเหมาะสำหรับการกำหนดพารามิเตอร์หลายตัวในกลุ่มเซลล์เดียวกันพร้อมกัน แม้ว่าค่าใช้จ่ายของสารรีแอนติบอดี้แอนติบอดีที่มีป้ายกำกับโดยตรงจะสูง แต่ก็ช่วยลดการรบกวนของการเรืองแสงที่ไม่เฉพาะเจาะจงที่แข็งแกร่งในวิธีการติดฉลากทางอ้อมและจึงเหมาะสำหรับการตรวจสอบตัวอย่างทางคลินิก (สอง) การติดฉลาก immunofluorescence ทางอ้อม ใช้เวลาในการระงับเซลล์จำนวนหนึ่ง (ประมาณ 1X106 เซลล์ / มล.) ก่อนเพิ่มแอนติบอดีแรกที่เฉพาะเจาะจงล้างแอนติบอดีที่ไม่ได้ผูกไว้หลังจากปฏิกิริยาเสร็จสมบูรณ์แล้วเพิ่มแอนติบอดีทุติยภูมิเรืองแสงที่มีข้อความ FCM จะตรวจจับการเรืองแสงที่ปล่อยออกมาจาก fluorescein ที่ติดฉลากหลังจากที่มันตื่นเต้น วิธีการนี้มีค่าใช้จ่ายต่ำและแอนติบอดีทุติยภูมิถูกใช้อย่างกว้างขวางและส่วนใหญ่จะใช้สำหรับการตรวจจับตัวอย่างทางวิทยาศาสตร์ อย่างไรก็ตามเนื่องจากแอนติบอดีทุติยภูมิโดยทั่วไปเป็นแอนติบอดี polyclonal ความจำเพาะไม่ดีและพื้นหลังเรืองแสงไม่เฉพาะมีความแข็งแรงซึ่งมีผลต่อผลการทดลองอย่างง่ายดาย ดังนั้นควรมีการเพิ่มการควบคุมเชิงลบหรือบวกในการจัดทำตัวอย่าง นอกจากนี้เนื่องจากขั้นตอนจำนวนมากในวิธีการติดฉลากแบบมาตรฐานทำให้การสูญเสียของเซลล์เพิ่มขึ้นและไม่เหมาะที่จะวัดชิ้นงานที่มีเซลล์จำนวนน้อย ไม่เหมาะกับฝูงชน ไม่มีเลย