การตรวจหาภูมิคุ้มกันของเชื้อ Helicobacter pylori

การทดสอบภูมิคุ้มกัน Helicobacter pylori ตรวจจับการติดเชื้อ H. pylori โดยการวัด Helicobacter pylori แอนติบอดีในซีรัมรวมถึงการตรวจ hemagglutination แบบพาสซีฟเทคนิคการกระตุ้นภูมิคุ้มกันและการทดสอบอิมมูโนซอร์บลิ้งค์ (ELISA) ผู้ป่วยใช้น้ำไขสันหลังและเจือจางแอนติเจนด้วยแผ่นฮีมโกลคูเทอเรชั่น V-type 96 หลุมเพื่อเจือจางแอนติเจน JE เพื่อให้แต่ละอันมี 25 ยูแอลและซีรั่มที่ได้รับการทดสอบนั้นถูกเจือจาง 1:10 เพิ่ม 25uL เพิ่ม lyocilized monoclonal antibody ในสมองของญี่ปุ่นเพื่อกระตุ้นเซลล์เม็ดเลือดแดงแกะ 25uL และสังเกตผลหลังจากยืนที่อุณหภูมิ 37 ° C เป็นเวลาหลายชั่วโมง ข้อมูลพื้นฐาน การจำแนกผู้เชี่ยวชาญ: การจำแนกประเภทการเจริญเติบโตและการพัฒนา: การตรวจเลือด บังคับเพศ: ไม่ว่าจะเป็นผู้ชายและผู้หญิงใช้การอดอาหาร: การอดอาหาร เคล็ดลับ: อย่าให้ท้องว่างจากการสอบ ค่าปกติ ผลลัพธ์เป็นลบ ความสำคัญทางคลินิก ผลลัพธ์ที่ผิดปกติ: 1. titer agglutination titer ของการทดสอบสูงกว่าการควบคุมแอนติเจน 4 เท่าหรือมากกว่า 4 เท่า แอนติเจน titer ในซีรั่มในช่วงระยะเวลาการกู้คืนเป็น 4 เท่าหรือมากกว่าสูงกว่าระยะเฉียบพลันและเป็นบวก 2. มีปฏิกิริยาสีพิเศษซึ่งพิสูจน์ว่ามีโปรตีนอยู่ 3. อัตราส่วนของซีรัมที่จะทดสอบกับซีรัมลบที่เป็นที่รู้จัก (P / N) ≥ 2.1 และค่า OD ของซีรัมที่จะทดสอบคือ, 0.4 จากนั้นจะพิจารณาว่าเป็นค่าบวก จำเป็นต้องตรวจสอบฝูงชน: ผู้ป่วยที่มีแผลในกระเพาะอาหาร ข้อควรระวัง ข้อห้ามก่อนการตรวจสอบ: ให้ความสนใจกับการปกป้องสมองเตรียมของเหลวบรรจุภัณฑ์ต่างๆและกำหนดค่าความเข้มข้น ข้อห้ามเมื่อตรวจสอบ: 1. ผู้ป่วยใช้น้ำไขสันหลังนั่งเพื่อหลีกเลี่ยงการบาดเจ็บที่ศีรษะ 2. โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ใช้ในการกระตุ้นเซลล์เม็ดเลือดแดงแกะให้มีสภาพแห้งก่อนการใช้งาน 3. ควรทำการเจือจางระยะเวลาในการออกฤทธิ์และอุณหภูมิของแอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิเพื่อกำหนดเงื่อนไขที่เหมาะสมสำหรับโปรตีนต่างๆ 4. โซลูชันการพัฒนาสีต้องได้รับการกำหนดค่าใหม่และในที่สุดก็เพิ่มลงใน H2O2 5. ป้ายกำกับมีศักยภาพที่จะก่อให้เกิดมะเร็งดังนั้นควรระมัดระวังเมื่อจัดการ 6. ควบคุมปัจจัยที่มีผลกระทบต่อประสิทธิภาพของการติดฉลากอย่างเคร่งครัดเช่นอุณหภูมิ, เวลา, pH, เอนไซม์และปริมาณแอนติบอดี 7. เมื่อติดตั้งคอลัมน์ให้ตั้งค่าคอลัมน์ให้เหมือนกันพื้นผิวทรงกระบอกแบนและไม่มีฟองอากาศหรือรอยร้าว กระบวนการตรวจสอบ ครั้งแรกการแข็งตัวของเลือดเรื่อย ๆ ผู้ป่วยใช้น้ำไขสันหลังและเจือจางแอนติเจนด้วยแผ่นฮีมโกลคูเทอเรชั่น V-type 96 หลุมเพื่อเจือจางแอนติเจน JE เพื่อให้แต่ละอันมี 25 ยูแอลและซีรั่มที่ได้รับการทดสอบนั้นถูกเจือจาง 1:10 เพิ่ม 25 uL และเพิ่มเซลล์เม็ดเลือดแดงแกะไวแสง 25 uL โดย lyocilized monoclonal antibody ในสมองของญี่ปุ่นและสังเกตผลลัพธ์หลังจากยืนที่อุณหภูมิ 37 ° C เป็นเวลาหลายชั่วโมง ประการที่สองเทคโนโลยี immunoblotting (A) ตัวอย่างโปรตีนที่ได้รับ: หลังจากการเหนี่ยวนำแบคทีเรียของการแสดงออกเซลล์สามารถ lysed โดยตรงโดยโหลดอิเล็กโทรโฟเรเซลล์เซลล์ยูคาริโอตบวกบัฟเฟอร์ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันอุณหภูมิห้องกลหรืออัลตราโซนิก homogenate 0.5-1 นาที จากนั้นก็หมุนเหวี่ยงที่ 13,000 กรัมเป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 ° C นำส่วนเหนือตัวอย่างมาเป็นตัวอย่าง (2) อิเล็กโตรโฟรีซิส: เจลอิเล็กโตรโฟรีซิสได้ถูกเตรียมและถูกจัดทำขึ้นภายใต้ระบบ SDS (3) การถ่ายโอน: (การถ่ายโอนกึ่งแห้ง) 1. หลังจากเสร็จสิ้นการ electrophoresis ตัดแถบให้มีขนาดที่เหมาะสมและปรับสมดุลด้วยบัฟเฟอร์เมมเบรน 5 นาที× 3 ครั้ง 2. การบำบัดด้วยเมมเบรน: กระดาษกรองและเมมเบรน NC ที่มีขนาดเดียวกับแถบถูกตัดและแช่ในบัฟเฟอร์การถ่ายโอนเป็นเวลา 10 นาที 3. ฟิล์มถ่ายโอน: ฟิล์มถ่ายโอนอุปกรณ์จะถูกจัดเรียงตามลำดับจากด้านล่างขึ้นบนตามลำดับของแผ่นขั้วบวกคาร์บอนกระดาษกรอง 24 ชั้นฟิล์ม NC แผ่นเจลแผ่นกระดาษกรอง 24 ชั้นและแผ่นคาร์บอนแคโทดแผ่นกระดาษกรองเจลและแผ่นฟิล์ม NC ถูกจัดเรียงอย่างแม่นยำ ฟองสบู่ถูกกำจัดออกไปในขั้นตอนเดียวและมีน้ำหนัก 500 กรัมนำไปใช้เพื่อทำให้ของเหลวส่วนเกินบนแผ่นคาร์บอนแห้ง เปิดพลังงานคงที่ในปัจจุบัน 1mA / cm2 ถ่ายโอน 1.5hr หลังจากการถ่ายโอนเสร็จสิ้นพลังจะถูกลบและเมมเบรนจะถูกนำออกและแถบที่จะถูกทดสอบจะถูกตัดเพื่อหาภูมิคุ้มกัน แถบมาตรฐานโปรตีนถูกย้อมสีวางไว้ในสารละลายการย้อมสีเมมเบรนเป็นเวลา 50 วินาทีและจากนั้นทำให้สีในเมทิลแอลกอฮอล์ 50% หลายครั้งไปยังพื้นหลังที่ชัดเจนจากนั้นล้างด้วยน้ำกลั่นสองครั้งเป่าให้แห้งด้วยกระดาษกรองสองชั้น ผลการเปรียบเทียบ (4) การตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน: 1. ล้างเมมเบรนด้วย 0.01 M PBS เป็นเวลา 5 นาที x 3 ครั้ง 2. เพิ่มน้ำยาเคลือบผิวและเขย่าเบา ๆ ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง 3. ทิ้งสารละลายและล้างเมมเบรนด้วย 0.01 M PBS เป็นเวลา 5 นาที× 3 ครั้ง 4. เพิ่มแอนติบอดีปฐมภูมิ (เจือจางด้วย 0.01 M PBS ในอัตราส่วนการเจือจางที่เหมาะสมของเหลวจะต้องครอบคลุมเมมเบรนทั้งหมด) และทิ้งไว้ที่ 4 ° C นานกว่า 12 ชั่วโมง ในการควบคุมเชิงลบแอนติบอดีปฐมภูมิจะถูกแทนที่ด้วย 1% บีเอสเอและขั้นตอนที่เหลือเหมือนกันในกลุ่มการทดลอง 5. ทิ้งแอนติบอดีปฐมภูมิและ 1% บีเอสเอและล้างเยื่อด้วย 0.01 M PBS, 5 นาที× 4 ครั้ง 6. เพิ่มแอนติบอดี้ทุติยภูมิพืชชนิดหนึ่ง peroxidase-conjugated (เจือจางด้วย 0.01 M PBS ในอัตราส่วนเจือจางที่เหมาะสม) และเขย่าเบา ๆ เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง 7. ทิ้งแอนติบอดีรองและล้างเยื่อด้วย 0.01 M PBS เป็นเวลา 5 นาที× 4 ครั้ง 8. เพิ่มสารละลายสีหลีกเลี่ยงแสงและพัฒนาสีจนกระทั่งแถบสีปรากฏขึ้นใส่ในน้ำกลั่นสองครั้งเพื่อหยุดปฏิกิริยา ประการที่สามการรวมการดูดซับของเอนไซม์ วิธี ELISA ที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ วิธีแซนด์วิชแอนติบอดีสองวิธีและวิธีทางอ้อมซึ่งเป็นวิธีแรกในการตรวจหาแอนติเจนของ macromolecular และวิธีหลังสำหรับการตรวจวัดแอนติบอดีจำเพาะ ทางอ้อม ELISA วิธีนี้ส่วนใหญ่จะใช้เพื่อตรวจหาแอนติบอดี ขั้นตอนสำหรับ ELISA ทางอ้อมมีดังนี้ (1) วัสดุ 1 เคลือบของเหลว, ของเหลวซักผ้า, ของเหลวเก็บรักษาความร้อน, ของเหลวพื้นผิวและหยุดของเหลว; แอนติเจนที่เคลือบ 2DVH, เอนไซม์ต่อต้านแอนติบอดี, ซีรั่มอ้างอิง DVH เชิงลบและบวก; เครื่องตรวจจับ ELISA 3 เครื่อง, ตัวอย่าง, โพลีสไตรีน microplate (2) ขั้นตอนวิธี 1 รวมทั้งการเคลือบแอนติเจน→ 4 ° C ค้างคืนล้างสามครั้งโยนแห้ง 2 บวกเซรั่มที่จะทดสอบ→ 37 ° C เป็นเวลา 2 ชั่วโมงล้างสามครั้งโยนแห้ง 3 บวกเอนไซม์ที่มีป้ายแอนติบอดี→ 37 ° C เป็นเวลา 2 ชั่วโมงล้างสามครั้งโยนแห้ง 4 เพิ่มโซลูชันพื้นผิว→ 37 ° C เป็นเวลา 30 นาทีเพิ่มโซลูชันหยุด 5 ค่า OD วัดโดยเครื่องตรวจจับ ELISA และคำนวณอัตราส่วน P / N 2. แซนวิชแอนติบอดีสองครั้ง ELISA วิธีนี้ส่วนใหญ่จะใช้ในการตรวจหา macromolecular antigens 1 บวกเคลือบแอนติบอดี→ 4 ° C ค้างคืนล้างสามครั้งโยนแห้ง 2 บวกแอนติเจนที่จะทดสอบ→ 37 ° C เป็นเวลา 30 นาทีล้างสามครั้งโยนแห้ง 3 บวกเอนไซม์ที่มีป้ายแอนติบอดี→ 37 ° C เป็นเวลา 30 นาทีล้างสามครั้งโยนแห้ง 4 เพิ่มโซลูชันพื้นผิว→ 37 ° C เป็นเวลา 15 นาทีเพิ่มโซลูชันหยุด 5 ค่า OD ถูกวัดโดยเครื่องทดสอบ ELISA ไม่เหมาะกับฝูงชน ไม่เหมาะสำหรับการตรวจสอบฝูงชน: ไม่มี ปฏิกิริยาและความเสี่ยงที่ไม่พึงประสงค์ ไม่มีภาวะแทรกซ้อนหรืออันตรายที่เกี่ยวข้อง