Analýza DNA průtokovou cytometrií

Analýza průtokovou cytometrickou DNA je vyšetřovací metoda, která může studovat interfázové buňky a není ovlivněna stavem buněčné proliferace, a je důležitá pro detekci maligních buněk v pleurálním výtoku. Rozsah detekce průtokovou cytometrií: 1. Průtoková cytometrie může detekovat buněčnou strukturu, včetně velikosti buněk, velikosti buněk, povrchové plochy buněk, poměru nukleoplasmů, obsahu DNA a buněčného cyklu, obsahu RNA, obsahu proteinů. 2. Průtoková cytometrie může detekovat buněčné funkce, včetně buněčných povrchových / cytoplazmatických / jaderně specifických antigenů, buněčných aktivit, intracelulárních cytokinů, enzymatických aktivit, hormonálních vazebných míst a buněčných receptorů. Základní informace Specializovaná klasifikace: klasifikace kardiovaskulárních vyšetření: vyšetření krve Použitelné pohlaví: zda muži a ženy používají půst: ne půst Tipy: Udržujte normální myšlení. Normální hodnota Tělo je v dynamické rovnováze bez onemocnění. Klinický význam Klinická aplikace průtokové cytometrie: 1. Aplikace průtokové cytometrie v onkologii Průtoková cytometrie může detekovat cyklus proliferace nádorových buněk, detekovat markery povrchových buněk nádorových buněk, produkty exprese onkogenů, provádět analýzu rezistence vůči více lékům a detekovat apoptózu; 2. použití průtokové cytometrie v hematologii pro detekci leukemických a lymfomových buněk, aktivovaných krevních destiček, počtu hematopoetických kmenových buněk (CD34 +), imunofenotypizace leukémií a lymfomů, počtu retikulocytů, křížové transplantace buněk a Sledování imunitního stavu; 3. Průtoková cytometrie v imunologii může být použita pro analýzu lymfocytů a jejich podskupin, imunofenotypizaci lymfocytů, detekci cytokinů. Abnormální výsledky Byly získány údaje o analýze průtokovou cytometrií 71 případů pleurálního výpotku, které ukázaly, že senzitivita maligního pleurálního výpotku byla 52% a specificita 100%. Při použití ve spojení s rutinním testováním může být citlivost diagnózy až 94%. DNA analýza rakovinných pleurálních efuzních buněk ukázala zvýšení podílu aneuploidních a S fázových, G2 / M fázových buněk. Lidé, kteří musí být vyšetřeni, jsou podezřelí z rakovinového výtoku z pleury a dalších souvisejících onemocnění. Opatření Průtoková cytometrie není plně automatizovaný přístroj. Přesné experimentální výsledky vyžadují přesné manuální techniky, a proto si příprava vzorku vyžaduje specifikaci a samotný přístroj vyžaduje kontrolu kvality. (1) Ovlivňující faktory a kontrola kvality imunologické detekce průtokovou cytometrií Průtoková cytometrie má v imunologii široké uplatnění: Příprava vzorků imunofluorescenčního barvení je velmi důležitá, často kvůli výskytu antropogenní nespecifické interference fluorescence (zejména při nepřímém imunofluorescenčním barvení) nebo nízké koncentraci buněk během přípravy vzorku. Výsledky zkoušek. Řešení těchto ovlivňujících faktorů jsou následující: (1) Zajistěte, aby koncentrace vzorku před detekcí stroje byla 1X106 buněk / ml a aby byla koncentrace buněk příliš nízká, což přímo ovlivňuje výsledek detekce. (2) Použití látek blokujících bílkoviny k blokování nespecifických vazebných míst je zvláště nezbytné pro nepřímé imunofluorescenční značení. Běžně používanými činidly blokujícími proteiny jsou 0,5% hovězí sérový albumin a 1% fetální hovězí sérum. (3) Fluorescenční protilátka je po barvení důkladně omyta, věnujte pozornost rychlosti míchání a odstřeďování a omezte překrývající se buňky a buněčný odpad. (4) Byl vytvořen kontrolní vzorek s použitím kontroly pozadí nesouvisejících kontrolních a fluorescenčních protilátek, které odpovídají stejnému zdroji protilátky. (5) Při posuzování výsledku by měla být věnována pozornost odečtení fluorescence pozadí. Aby byla kvantitativní analýza imunofluorescence přesnější, používá se software počítačového programu k odečtení vrcholu křivky kontrolní skupiny od vrcholu křivky experimentální skupiny metodou přizpůsobovací křivky. Lze získat přesnější imunofluorescenční kvantitativní výsledky. (6) Dávejte pozor, abyste se po barvení vyhnuli světlu, abyste zajistili stabilitu buněčné imunofluorescence. (2) Stále neexistuje jednotný standard pro kontrolu kvality analýzy ploidy DNA. Experimentální výsledky uváděné v různých literaturách jsou zcela odlišné. V říjnu 1993 vypracovala Americká organizace pro výzkum rakoviny jednotný standard pro stanovení DNA FCM, který jsme kombinovali podle těchto standardů. Zkušení odborníci již mnoho let praktikují vysvětlení kontroly kvality a preventivních opatření technologie FCM pro analýzu DNA. (1) Pokud se odebírají čerstvé vzorky pro chirurgickou resekci nebo biopsické jehly, je třeba se vyhnout hemoragické nekrotické tkáni. (2) Vzorky by měly být fixovány nebo kryokonzervovány včas po odběru, aby nedošlo k autolýze a degradaci DNA, což by mělo za následek chyby ve výsledcích zkoušek. (3) Fixační prostředek by měl přijmout koncentraci, která vysoce proniká do tkáňových buněk, a 70% ethanolu je lepší. (4) Během přípravy jednobuněčné suspenze dávejte pozor, abyste oddělili komponenty testovaných buněk, omezili rušení ostatních složek a dbejte, aby nedošlo k poškození buněk. (5) Odběr vzorků buněk by měl zajistit dostatečnou koncentraci buněk, tj. 1 × 106 buněk / ml, nečistoty, trosky, shluky a překrývající se buňky by měly být <2% a mělo by být analyzováno alespoň 20% vzorků aneuploidů DNA nádorových buněk. Jsou přítomny nádorové buňky. (6) Při přípravě jednotlivé buňky tkáně zalité do parafinu by měla být věnována pozornost výběru tkáně bez autolýzy a nekrózy. Pro vzorek nádorové tkáně je vybrána oblast obsahující nádorové buňky, měla by být vhodná tloušťka vrstvy parafinové tkáně, nejlépe 40 až 50 μm. Nadměrně tenké nebo příliš silné plátky ovlivní výsledky testu, důkladně zbavte vosku, abyste zabránili zbytkovému parafinu ovlivnit trávicí aktivitu enzymu. Ověřte, že odstranění vosku je úplné odstraněním xylenu a přidáním 100% ethanolu. Plovoucí, což naznačuje, že vosk byl odstraněn; hydratace postačuje k obnovení tkáně do stavu podobného čerstvé tkáni; věnujte pozornost času trávení a aktivitě trávicích enzymů. Rutinně bylo použito 0,5% pepsinu, pH 1,5. (3) Provozní aspekty (1) Průtokový cytometr je v pracovním procesu v optimálním stavu, který může zajistit přesnost a přesnost kvantitativní detekce. Pomocí standardního vzorku k úpravě variačního koeficientu přístroje na minimální rozsah je rozlišení v nejlepším stavu, aby nedošlo k chybám detekce způsobeným změnami podmínek přístroje během procesu měření. (2) Důležitým indexem pro vyhodnocení přesnosti přístroje je variační koeficient (CV) přístroje. U kalibračního vzorku platí, že čím menší je hodnota CV, tím menší je hodnota CV, což znamená, že přesnost kalibrace přístroje je vyšší. Kalibrační vzorky zahrnují nebiologické vzorky (fluorescenční mikrosféry) a vzorky biologických buněk (lidské lymfocyty, kuřecí červené krvinky atd.). V současné době mají nebiosluminiscenční mikrosféry komerční činidla a CV je obecně <2% až 3%. (4) Analýza dat (1) Pokud je ve vzorku příliš mnoho nečistot nebo aglomerátů, je počet měřených buněk pod 20% a základní linie histogramu by měla být opuštěna. (2) Při provádění analýzy buněčného cyklu by měl být počet buněk vzorku 10 000, s výjimkou zbytků, nečistot a aglomerátů. Pokud počet aneuploidních buněk představuje méně než 10% z celkového počtu buněk, je nutné kombinovat další diagnostické ukazatele. Závěrem lze říci, že alespoň aneuploidní buňky představují více než 20% z celkového počtu buněk a lze stanovit přítomnost aneuploidů. (3) Při analýze DNA byla analýza opuštěna, když hodnota CV normální skupiny diploidních buněk byla> 8%, ale hodnota CV nádorových buněk byla> 8%, což souviselo s heterogenitou nádorových buněk. Při analýze DNA ploidy se navíc unáší 10% jednotlivců v homologní tkáni. (4) Kontrola kvality standardů DNA ploidy pomocí stejné individuální homologní normální tkáně, stejné fixační metody, stejné metody zpracování vzorku, stejné metody barvení, současného barvení, stejných podmínek detekce nástroje, normální diploidní tkáně jako Vnitřní standard. Proces inspekce Analýza průtokovou cytometrií: buňky v pleurální tekutině byly přímo obarveny fluorescenčními barvivy (jako je propidium jodid) a obsah DNA, distribuce buněčného cyklu a DNA ploidy buněk pleurální tekutiny byly analyzovány průtokovou cytometrií. Příprava vzorků pro rutinní testování průtokovou cytometrií: (1) Přímé imunofluorescenční značení Vezměte určité množství buněk (přibližně 1X106 buněk / ml), přímo přidejte protilátku konjugovanou s fluoresceinem pro imunooznačující reakci (jako je dvojité značení nebo vícenásobné značení, přidejte několik protilátek značených různými fluoresceiny současně), inkubujte Po 20 až 60 minutách se promyje jednou nebo dvakrát PBS (pH 7,2 až 7,4), resuspenduje se v pufru a testuje se na stroji. Metoda má výhody jednoduchého ovládání, přesného výsledku a snadné analýzy a je vhodná pro současné stanovení více parametrů stejné buněčné skupiny. I když jsou náklady na přímo značené protilátkové činidlo vysoké, snižuje interference silné nespecifické fluorescence při nepřímém značení, a je tedy vhodnější pro detekci klinických vzorků. (2) nepřímé imunofluorescenční značení Vezměte určité množství buněčné suspenze (přibližně 1X106 buněk / ml), nejprve přidejte specifickou první protilátku, po dokončení reakce promyjte nenavázanou protilátku a poté přidejte fluorescenčně značenou sekundární protilátku, aby se vytvořil komplex antigen-protilátka-protilátka FCM detekuje fluorescenci emitovanou značeným fluoresceinem po excitaci. Metoda je nízká, a sekundární protilátka je široce používána a je většinou používána pro detekci vědeckých vzorků. Protože však sekundární protilátka je obecně polyklonální protilátka, specificita je nízká a nespecifické fluorescenční pozadí je silné, což snadno ovlivňuje experimentální výsledky. K přípravě vzorku by proto měla být přidána negativní nebo pozitivní kontrola. Kromě toho se v důsledku velkého počtu kroků ve standardní metodě značení zvyšuje ztráta buněk a není vhodné měřit vzorky s malým počtem buněk. Nevhodné pro dav Ne.