Imunologická detekce Helicobacter pylori

Imunologické testy Helicobacter pylori detekují infekci H. pylori měřením protilátek proti Helicobacter pylori v séru, včetně pasivních hemaglutinačních testů, imunoblotovacích technik a enzymatických imunosorbentových testů (ELISA). Pacient vzal mozkomíšní tekutinu a zředil antigen 96-jamkovou hemaglutinační destičkou typu V, aby se zředil JE antigen, takže každá jamka obsahovala 25 ul a testované sérum se ředilo 1:10 s každým ředěním. Přidá se 25 ul, přidá se lyofilizovaná japonská mozková monoklonální protilátka k senzibilizaci ovčích červených krvinek 25 ul a výsledky se pozorují po několikhodinovém stání při 37 ° C. Základní informace Specializovaná klasifikace: klasifikace vyšetření růstu a vývoje: vyšetření krve Použitelné pohlaví: zda muži a ženy používají půst: půst Tipy: Udržujte před zkouškou prázdný žaludek. Normální hodnota Výsledek byl negativní. Klinický význam Abnormální výsledky: 1. Sérový aglutinační titr testu je čtyřikrát nebo více než čtyřikrát vyšší než kontrola antigenu. Titr sérového antigenu během regenerační periody byl 4 nebo vícekrát vyšší než akutní fáze a byl pozitivní. 2. Existuje zvláštní barevná reakce, která prokazuje, že určitý protein existuje. 3. Poměr testovaného séra ke známému negativnímu séru (P / N) ≥ 2,1 a hodnota OD testovaného séra je ≥ 0,4, pak je považován za pozitivní. Potřeba zkontrolovat dav: pacienti s peptickým vředem. Opatření Kontraindikace před kontrolou: Věnujte pozornost ochraně mozku, připravte různé balicí tekutiny a nakonfigurujte koncentraci. Tabu při kontrole: 1. Pacient si vezme mozkomíšní tekutinu k sezení, aby nepoškodil hlavu. 2. Monoklonální protilátky používané ke senzibilizaci ovčích červených krvinek, které mají být před použitím lyofilizovány. 3. Zředění, doba působení a teplota primárních a sekundárních protilátek by měly být předem experimentovány, aby se stanovily optimální podmínky pro různé proteiny. 4. Roztok vyvíjející barvu musí být čerstvě nakonfigurován a nakonec přidán do H2O2. 5. DAB má potenciál způsobit rakovinu, proto buďte při manipulaci opatrní. 6. Přísně kontrolní faktory ovlivňující účinnost značení, jako je teplota, čas, pH, množství enzymu a množství protilátky. 7. Při instalaci sloupu vyrovnejte sloupec, povrch válce je rovný a nevyskytují se zde žádné bubliny ani praskliny. Proces inspekce Nejprve pasivní koagulace krve Pacient vzal mozkomíšní tekutinu a zředil antigen 96-jamkovou hemaglutinační destičkou typu V, aby se zředil JE antigen, takže každá jamka obsahovala 25 ul a testované sérum se ředilo 1:10 s každým ředěním. Přidejte 25 ul a přidejte 25 ul senzitizovaných ovčích červených krvinek lyofilizovanou japonskou mozkovou monoklonální protilátkou a pozorujte výsledky po několikhodinovém stání při 37 ° C. Druhá, imunoblotová technologie (A) získaný vzorek proteinu: po bakteriální indukci exprese mohou být buňky přímo lyžovány elektroforézním nanášecím pufrem, eukaryotickými buňkami plus homogenizačním pufrem, mechanickým nebo ultrazvukovým homogenizátorem pokojové teploty 0,5 - 1 min. Poté byl odstřeďován při 13 000 g po dobu 15 minut při 4 ° C. Supernatant odeberte jako vzorek. (2) Elektroforéza: Byl připraven elektroforézní gel a byl podroben SDS-PAGE. 3) Transfer: (polosuchý transfer) 1. Poté, co je elektroforéza ukončena, ořízněte proužek na vhodnou velikost a ekvilibrujte membránovým pufrem, 5 x 3krát. 2. Zpracování membránou: Filtrační papír a NC membrána stejné velikosti jako proužek byly předem nařezány a ponořeny do přenosového pufru po dobu 10 minut. 3. Přenosový film: Zařízení pro přenos filmu je umístěno v pořadí zdola nahoru podle pořadí anodové uhlíkové desky, 24 vrstev filtračního papíru, NC filmu, gelu, 24 vrstev filtračního papíru a katodové uhlíkové desky. Filtrační papír, gel a NC film jsou přesně vyrovnány. Bubliny byly odstraněny v jednom kroku a bylo na ně naneseno závaží 500 g pro vysušení přebytečné kapaliny na uhlíkové desce. Zapněte napájení, konstantní proud 1 mA / cm2, přenos 1,5 hodiny. Po dokončení přenosu se síla odstraní a membrána se vyjme a testovaný proužek se odřízne pro imunoblotování. Proužky standardního proteinu byly obarveny, umístěny do roztoku pro barvení membrán na 50 sekund a poté několikrát odbarveny v 50% methanolu na čiré pozadí, poté promyty dvakrát destilovanou vodou, sušeny na vzduchu ve dvou vrstvách filtračního papíru a ponechány zbarvené Výsledky jsou porovnány. (4) Imunitní odpověď: 1. Promyjte membránu 0,01 M PBS po dobu 5 minut x 3x. 2. Přidejte potahovací roztok a jemně protřepávejte při pokojové teplotě po dobu 2 hodin. 3. Roztok zlikvidujte a membránu promyjte 0,01 M PBS po dobu 5 minut x 3krát. 4. Přidejte primární protilátku (zředěnou 0,01 M PBS ve vhodném ředicím poměru, kapalina musí pokrýt celou membránu) a nechte při 4 ° C déle než 12 hodin. V negativní kontrole byla primární protilátka nahrazena 1% BSA a zbývající kroky byly stejné jako v experimentální skupině. 5. Zlikvidujte primární protilátku a 1% BSA a promyjte membránu 0,01 M PBS, 5 min x 4krát. 6. Přidá se sekundární protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou (zředěná 0,01 M PBS ve vhodném ředicím poměru) a jemně protřepává 2 hodiny při teplotě místnosti. 7. Zlikvidujte sekundární protilátku a promyjte membránu 0,01 M PBS po dobu 5 minut x 4krát. 8. Přidejte barvicí roztok, vyhněte se světlu a vyvíjejte barvu, dokud se neobjeví pásek. Pro zastavení reakce přidejte dvakrát destilovanou vodu. Za třetí, enzymové kombinované stanovení adsorpce Mezi běžně používané metody ELISA patří sendvičová metoda s dvojitou protilátkou a nepřímá metoda, první metoda pro detekci makromolekulárních antigenů a druhá metoda pro měření specifických protilátek. Nepřímá ELISA Tato metoda se používá hlavně k detekci protilátek. Postup pro nepřímou ELISA je následující. (1) Materiály 1 potahovací kapalina, promývací kapalina, tepelná konzervační kapalina, substrátová kapalina a zastavovací kapalina; 2DVH potažený antigen, enzymem značená anti-protilátka, negativní a pozitivní DVH referenční sérum; 3 ELISA detektor, vzorkovač, polystyrenová mikrodestička. (2) Kroky metody 1 plus potahování antigenem → 4 ° C přes noc, třikrát promyté, házet do sucha; 2 plus sérum, které se má testovat → 37 ° C po dobu 2 hodin, třikrát se promyje, suší se; 3 plus enzymem značená protilátka → 37 ° C po dobu 2 hodin, třikrát promyta, usušena; 4 přidejte roztok substrátu → 37 ° C po dobu 30 minut, přidejte zastavovací roztok; 5 Hodnota OD byla měřena detektorem ELISA a byl vypočten poměr P / N. 2. ELISA s dvojitou protilátkou Tato metoda se používá hlavně k detekci makromolekulárních antigenů. 1 plus povlak protilátky → 4 ° C přes noc, promytý třikrát, házet do sucha; 2 plus antigen, který má být testován → 37 ° C po dobu 30 minut, třikrát promytý, suchý; 3 plus enzymem značená protilátka → 37 ° C po dobu 30 minut, třikrát promyta, usušena; 4 přidejte roztok substrátu → 37 ° C po dobu 15 minut, přidejte zastavovací roztok; 5 Hodnota OD byla měřena testerem ELISA. Nevhodné pro dav Nevhodné pro kontrolu davu: žádné. Nežádoucí účinky a rizika Žádné související komplikace nebo rizika.