transferencia occidental

La inmunotransferencia es la transferencia de proteínas a una membrana y la posterior detección con anticuerpos. Para la proteína expresada conocida, el anticuerpo correspondiente puede usarse como el anticuerpo primario para la detección. El producto de expresión del nuevo gen puede ser detectado por la parte de fusión del anticuerpo, y tiene las ventajas de una gran capacidad analítica, alta sensibilidad, fuerte especificidad, etc. Uno de los métodos de expresión y distribución más utilizados, como la detección cualitativa y cuantitativa de antígenos tisulares, la determinación de masas de moléculas de polipéptidos y la detección de anticuerpos o antígenos de virus. Información básica Clasificación de especialistas: clasificación de verificación de crecimiento y desarrollo: examen bioquímico Género aplicable: si los hombres y las mujeres aplican en ayunas: no en ayunas Consejos: obedezca las instrucciones del médico. Valor normal Sin reacción especial de color. Importancia clínica Resultados anormales: hay una reacción de color especial, que prueba que existe cierta proteína. Necesidad de controlar a la multitud: verifique una determinada proteína. Precauciones Tabú al verificar: Ninguno. Tabú al verificar: 1. La dilución, el tiempo de acción y la temperatura del anticuerpo primario y el anticuerpo secundario se determinan mediante un experimento previo para determinar las condiciones óptimas para diferentes proteínas. 2. La solución de revelado de color debe estar recién configurada y utilizada, y finalmente se agrega H2O2. 3, DAB tiene el potencial de carcinogenicidad, tenga cuidado al manipularlo. Proceso de inspección (A) muestra de proteína obtenida: después de la inducción bacteriana de la expresión, las células se pueden lisar directamente mediante tampón de carga de electroforesis, células eucariotas más tampón de homogeneización, homogeneizado mecánico o ultrasónico a temperatura ambiente 0.5-1min. Luego se centrifugó a 13,000 g durante 15 minutos a 4 ° C. Tome el sobrenadante como muestra. (2) Electroforesis: se preparó un gel de electroforesis y se sometió a SDS-PAGE. (3) Transferencia: (transferencia semiseca) 1. Una vez finalizada la electroforesis, corte la tira al tamaño apropiado y equilibre con el tampón de membrana, 5 min × 3 veces. 2. Tratamiento de membrana: el papel de filtro y la membrana NC del mismo tamaño que la tira se cortaron previamente y se sumergieron en el tampón de transferencia durante 10 minutos. 3. Película de transferencia: el dispositivo de transferencia de película se coloca en orden de abajo hacia arriba de acuerdo con el orden de la placa de carbono del ánodo, 24 capas de papel de filtro, película de NC, gel, 24 capas de papel de filtro y placa de carbono de cátodo. El papel de filtro, el gel y la película de NC están alineados con precisión. Las burbujas se eliminaron en una etapa, y se aplicó un peso de 500 g a la misma para secar el exceso de líquido en la placa de carbón. Encienda la energía, corriente constante 1mA / cm2, transfiera 1.5hr. Después de que se completa la transferencia, se quita la energía y se saca la membrana, y la tira a analizar se corta para inmunotransferencia. Las tiras estándar de proteína se tiñeron, se colocaron en la solución de tinción de membrana durante 50 segundos y luego se decoloraron en metanol al 50% varias veces hasta un fondo claro, luego se lavaron con agua doblemente destilada, se secaron al aire en dos capas de papel de filtro y se dejaron a color. Los resultados son comparados. (4) Respuesta inmune: 1. Lave la membrana con PBS 0.01 M durante 5 min x 3 veces. 2. Agregue la solución de recubrimiento y agite suavemente a temperatura ambiente durante 2 horas. 3. Deseche la solución y lave la membrana con PBS 0.01 M durante 5 min × 3 veces. 4. Agregue el anticuerpo primario (diluido con PBS 0.01 M en una proporción de dilución adecuada, el líquido debe cubrir toda la membrana) y déjelo a 4 ° C durante más de 12 h. En el control negativo, el anticuerpo primario se reemplazó con 1% de BSA, y los pasos restantes fueron los mismos que en el grupo experimental. 5. Deseche el anticuerpo primario y el 1% de BSA, y lave la membrana con PBS 0.01 M, 5 min × 4 veces. 6. Agregue el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (diluido con PBS 0.01 M en la proporción de dilución apropiada) y agite suavemente durante 2 horas a temperatura ambiente. 7. Deseche el anticuerpo secundario y lave la membrana con PBS 0.01 M durante 5 min × 4 veces. 8. Agregue la solución colorante, evite la luz y desarrolle el color hasta que aparezca la banda. Coloque el agua doblemente destilada para detener la reacción. No apto para la multitud. No apto para la multitud: no. Reacciones adversas y riesgos No hay complicaciones o riesgos relacionados.