Western blot

L'immunoblot est le transfert de protéines sur une membrane et sa détection ultérieure à l'aide d'anticorps. Pour la protéine exprimée connue, l'anticorps correspondant peut être utilisé comme anticorps primaire pour la détection.Le produit d'expression du nouveau gène peut être détecté par la partie de fusion de l'anticorps et présente les avantages d'une grande capacité analytique, d'une grande sensibilité, d'une forte spécificité, etc. L'une des méthodes d'expression et de distribution les plus couramment utilisées, telles que la détection qualitative et quantitative des antigènes tissulaires, la détermination en masse des molécules de polypeptides et la détection des anticorps ou des antigènes de virus. Informations de base Classification de spécialiste: classification de contrôle de croissance et de développement: examen biochimique Sexe applicable: si les hommes et les femmes appliquent le jeûne: pas le jeûne Conseils: respectez les instructions du médecin. Valeur normale Aucune réaction de couleur spéciale. Signification clinique Résultats anormaux: Il existe une réaction colorée particulière, qui prouve qu’une certaine protéine existe. Besoin de vérifier la foule: recherchez une certaine protéine. Précautions Tabou lors de la vérification: aucun. Tabou lors de la vérification: 1. La dilution, le temps d'action et la température de l'anticorps primaire et de l'anticorps secondaire sont déterminés par pré-expérience afin de déterminer les conditions optimales pour différentes protéines. 2. La solution de développement couleur doit être configurée et utilisée à nouveau, et H2O2 est ajouté. 3, DAB a un potentiel de cancérogénicité, soyez prudent lors de la manipulation. Processus d'inspection (A) échantillon de protéine obtenu: après l'induction d'expression bactérienne, les cellules peuvent être directement lysées par un tampon de charge pour électrophorèse, des cellules eucaryotes et un tampon d'homogénéisation, un homogénat à température ambiante mécanique ou à ultrasons de 0,5 à 1 min. Il a ensuite été centrifugé à 13 000 g pendant 15 min à 4 ° C. Prenez le surnageant comme échantillon. (2) Electrophorèse: un gel d'électrophorèse a été préparé et soumis à une SDS-PAGE. (3) Transfert: (transfert semi-sec) 1. Une fois l'électrophorèse terminée, coupez la bande à la taille appropriée et équilibrez-la avec le tampon de membrane 5 fois par 3 fois. 2. Traitement par membrane: le papier filtre et la membrane NC de la même taille que la bande ont été prédécoupés et immergés dans le tampon de transfert pendant 10 min. 3. Film de transfert: Le dispositif de transfert de film est placé dans l'ordre, de bas en haut, selon l'ordre suivant: plaque de carbone anodique, 24 couches de papier filtre, film CN, gel, 24 couches de papier filtre et plaque de carbone cathodique, le papier filtre, le gel et le film NC étant alignés avec précision. Les bulles ont été éliminées en une étape et un poids de 500 g y a été appliqué pour sécher le liquide en excès sur la plaque de carbone. Mettez sous tension, courant constant 1mA / cm2, transférez 1,5 heure. Une fois le transfert terminé, l’alimentation est coupée, la membrane retirée et la bande à tester est découpée pour immunoblot. Les bandes de protéines standard ont été colorées, placées dans la solution de coloration membranaire pendant 50 secondes, puis décolorées plusieurs fois dans un mélange de méthanol à 50% jusqu'à obtenir un fond transparent, puis lavées avec de l'eau bidistillée, séchées à l'air dans deux couches de papier filtre et laissées à colorer. Les résultats sont comparés. (4) réponse immunitaire: 1. Laver la membrane avec du PBS 0,01 M pendant 5 min x 3 fois. 2. Ajouter la solution de revêtement et agiter doucement à la température ambiante pendant 2 heures. 3. Jeter la solution et laver la membrane avec du PBS 0,01 M pendant 5 min × 3 fois. 4. Ajouter l'anticorps primaire (dilué avec du PBS 0,01 M dans un rapport de dilution approprié, le liquide doit recouvrir toute la membrane) et laisser à 4 ° C pendant plus de 12 heures. Dans le contrôle négatif, l'anticorps primaire a été remplacé par 1% de BSA et les étapes restantes étaient les mêmes que dans le groupe expérimental. 5. Jeter l'anticorps primaire et 1% de BSA et laver la membrane avec du PBS 0,01 M, 5 min x 4 fois. 6. Ajouter l'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (dilué avec du PBS 0,01 M au rapport de dilution approprié) et agiter doucement pendant 2 heures à la température ambiante. 7. Jeter l'anticorps secondaire et laver la membrane avec du PBS 0,01 M pendant 5 min x 4 fois. 8. Ajoutez la solution de coloration, évitez la lumière et développez la couleur jusqu'à ce que la bande apparaisse. Mettez dans l'eau bidistillée pour arrêter la réaction. Ne convient pas à la foule Ne convient pas à la foule: non. Effets indésirables et risques Aucune complication ou danger associé.