Analisi del DNA citometrico a flusso

L'analisi del DNA citometrico a flusso è un metodo di esame che può studiare le cellule interfase e non è influenzato dallo stato di proliferazione cellulare ed è importante per rilevare le cellule maligne nell'effusione pleurica. Intervallo di rilevamento della citometria a flusso: 1. La citometria a flusso è in grado di rilevare la struttura della cellula, comprese le dimensioni, la dimensione, l'area della superficie cellulare, il rapporto nucleoplasmatico, il contenuto di DNA e il ciclo cellulare, il contenuto di RNA, il contenuto di proteine. 2. La citometria a flusso può rilevare le funzioni cellulari, inclusi gli antigeni specifici della superficie cellulare / citoplasmatici / nucleari, le attività cellulari, le citochine intracellulari, le attività enzimatiche, i siti di legame agli ormoni e i recettori cellulari. Informazioni di base Classificazione specialistica: classificazione dell'esame cardiovascolare: esame del sangue Genere applicabile: se uomini e donne applicano il digiuno: non il digiuno Suggerimenti: mantenere una mentalità normale. Valore normale Il corpo è in un equilibrio dinamico senza malattie. Significato clinico Applicazione clinica della citometria a flusso: 1. Applicazione della citometria a flusso in oncologia La citometria a flusso può rilevare il ciclo di proliferazione delle cellule tumorali, rilevare marcatori di superficie delle cellule tumorali, prodotti di espressione dell'oncogene, condurre analisi di resistenza a più farmaci e rilevare l'apoptosi; 2. Applicazione della citometria a flusso in ematologia per rilevare cellule di leucemia e linfoma, piastrine attivate, conta delle cellule staminali ematopoietiche (CD34 +), immunofenotipizzazione di leucemie e linfomi, conta dei reticolociti, cross-match del trapianto di cellule e Monitoraggio dello stato immunitario; 3. La citometria a flusso in immunologia può essere utilizzata per i linfociti e l'analisi dei suoi sottogruppi, l'immunofenotipizzazione dei linfociti, la rilevazione di citochine. Risultati anormali Vi sono stati dati sull'analisi della citometria a flusso di 71 casi di versamento pleurico I risultati hanno mostrato che la sensibilità del versamento pleurico maligno era del 52% e la specificità era del 100%. Se utilizzato insieme ai test di routine, la sensibilità della diagnosi può arrivare fino al 94%. L'analisi del DNA delle cellule cancerose di versamento pleurico ha mostrato un aumento della proporzione di cellule aneuploidi e in fase S, G2 / M. Le persone che devono essere esaminate sono sospettate di avere versamento pleurico canceroso e altre malattie correlate. precauzioni La citometria a flusso non è uno strumento completamente automatizzato. Risultati sperimentali accurati richiedono tecniche manuali accurate, pertanto la preparazione dei campioni richiede specifiche e lo strumento stesso richiede un controllo di qualità. (1) Fattori che influenzano e controllo di qualità del rilevamento immunologico della citometria a flusso La citometria a flusso ha una vasta gamma di applicazioni in immunologia La preparazione di campioni di colorazione immunofluorescente è molto importante, spesso a causa del verificarsi di interferenze antropogeniche non specifiche di fluorescenza (specialmente nella colorazione di immunofluorescenza indiretta) o di bassa concentrazione cellulare durante la preparazione del campione. Risultati del test Le soluzioni a questi fattori influenti sono le seguenti: (1) Assicurarsi che la concentrazione del campione prima che venga rilevata la macchina sia 1X106 cellule / ml e che la concentrazione cellulare sia troppo bassa, il che influenza direttamente il risultato del rilevamento. (2) L'uso di agenti bloccanti delle proteine ​​per bloccare siti di legame non specifici è particolarmente necessario per l'etichettatura dell'immunofluorescenza indiretta. Agenti bloccanti delle proteine ​​comunemente usati sono lo 0,5% di albumina sierica bovina e l'1% di siero bovino fetale. (3) L'anticorpo fluorescente viene lavato accuratamente dopo la colorazione, prestare attenzione alla velocità di miscelazione e centrifugazione e ridurre le cellule sovrapposte e i detriti cellulari. (4) È stato creato un campione di controllo usando un controllo di fondo di controllo non correlato e anticorpi fluorescenti che corrispondevano alla stessa fonte di anticorpo. (5) Nel giudicare il risultato, occorre prestare attenzione alla sottrazione della fluorescenza di fondo. Al fine di rendere più accurata l'analisi quantitativa dell'immunofluorescenza, il software del programma informatico viene utilizzato per sottrarre il picco di curva del gruppo di controllo dal picco di curva del gruppo sperimentale con il metodo della curva di adattamento. È possibile ottenere risultati quantitativi di immunofluorescenza più accurati. (6) Prestare attenzione a evitare la luce dopo la tintura per garantire la stabilità dell'immunofluorescenza cellulare. (2) Non esiste ancora uno standard uniforme per il controllo di qualità dell'analisi della ploidia del DNA. I risultati sperimentali riportati in varie letterature sono piuttosto diversi. Nell'ottobre 1993, l'American Cancer Research Organization ha sviluppato uno standard unificato per la determinazione del DNA FCM, che abbiamo combinato secondo questi standard. Esperti esperti hanno praticato per molti anni per spiegare il controllo di qualità e le precauzioni della tecnologia di analisi del DNA di FCM. (1) Quando si prelevano campioni freschi per la resezione chirurgica o gli aghi per biopsia, è necessario evitare il tessuto necrotico emorragico. (2) I campioni devono essere fissati o sottoposti a crioconservazione in tempo dopo la raccolta per evitare l'autolisi e la degradazione del DNA, con conseguenti errori nei risultati dei test. (3) Il fissativo dovrebbe adottare una concentrazione altamente penetrante nelle cellule dei tessuti e il 70% dell'etanolo è migliore. (4) Durante la preparazione della sospensione di una singola cellula, fare attenzione a separare i componenti delle cellule da testare, ridurre l'interferenza di altri componenti e fare attenzione a non danneggiare le cellule. (5) La raccolta di campioni di cellule dovrebbe garantire una concentrazione cellulare sufficiente, ovvero 1 × 10 6 cellule / ml, impurità, detriti, ammassi e cellule sovrapposte dovrebbe essere <2% e almeno il 20% dei campioni di aneuploidi del DNA delle cellule tumorali. Sono presenti cellule tumorali. (6) Quando si prepara la singola cellula di tessuto incorporato in paraffina, occorre prestare attenzione alla selezione del tessuto senza autolisi e necrosi. Per il campione di tessuto tumorale, viene selezionata l'area contenente le cellule tumorali; lo spessore del foglio di tessuto di paraffina deve essere adatto, preferibilmente Da 40 a 50 μm. Fette eccessivamente sottili o troppo spesse influiranno sui risultati del test; accuratamente deparaffinate per evitare che la paraffina residua influisca sull'attività digestiva dell'enzima. Verificare che la deparaffinazione sia completa eliminando lo xilene e aggiungendo etanolo al 100%. Galleggiante, che indica che la cera è stata rimossa; l'idratazione è sufficiente per ripristinare il tessuto a uno stato simile al tessuto fresco; prestare attenzione al tempo di digestione e all'attività degli enzimi digestivi. Lo 0,5% di pepsina è stato usato di routine, pH 1,5. (3) Aspetti operativi (1) Il citometro a flusso è in uno stato ottimale durante tutto il processo di lavoro, il che può garantire l'accuratezza e l'accuratezza del rilevamento quantitativo. Utilizzando il campione standard per adattare il coefficiente di variazione dello strumento al range minimo, la risoluzione è nello stato migliore, per evitare errori di rilevamento causati da cambiamenti nelle condizioni dello strumento durante il processo di misurazione. (2) L'indice importante per valutare l'accuratezza dello strumento è il coefficiente di variazione (CV) dello strumento.Per il campione di calibrazione, più piccolo è il valore CV, più piccolo è il valore CV, indicando che l'accuratezza della calibrazione dello strumento è maggiore. I campioni di calibrazione includono campioni non biologici (microsfere fluorescenti) e campioni di cellule biologiche (linfociti umani, globuli rossi di pollo, ecc.). Allo stato attuale, le microsfere non bioluminescenti hanno reagenti commerciali e CV è generalmente <2% al 3%. (4) Analisi dei dati (1) Quando ci sono troppi detriti o agglomerati nel campione, il numero di cellule misurate è inferiore al 20% e la linea di base dell'istogramma deve essere abbandonata. (2) Quando si esegue l'analisi del ciclo cellulare, il numero di cellule campione dovrebbe essere 10.000, esclusi detriti, impurità e agglomerati.Quando il numero di cellule aneuploidi rappresenta meno del 10% del numero totale di cellule, è necessario combinare altri indicatori diagnostici. In conclusione, almeno le cellule aneuploidi rappresentano oltre il 20% del numero totale di cellule e può essere determinata la presenza di aneuploidi. (3) Nell'analisi del DNA, l'analisi è stata abbandonata quando il valore CV del normale gruppo di cellule diploidi era> 8%, ma il valore CV delle cellule tumorali era> 8%, che era correlato all'eterogeneità delle cellule tumorali. Inoltre, nell'analisi della ploidia del DNA, il 10% degli individui nel tessuto omologa andrà alla deriva. (4) Controllo di qualità degli standard di ploidia del DNA, utilizzando lo stesso tessuto normale omologo individuale, lo stesso metodo di fissazione, lo stesso metodo di elaborazione del campione, lo stesso metodo di colorazione, colorazione simultanea, le stesse condizioni di rilevamento dello strumento, tessuto diploide normale come Standard interno. Processo di ispezione Analisi della citometria a flusso: le cellule del fluido pleurico sono state colorate direttamente con coloranti fluorescenti (come lo ioduro di propidio) e il contenuto di DNA, la distribuzione del ciclo cellulare e la ploidia del DNA delle cellule del fluido pleurico sono state analizzate mediante citometria a flusso. Preparazione del campione per test di routine mediante citometria a flusso: (1) Etichettatura diretta dell'immunofluorescenza Prendi una certa quantità di cellule (circa 1X106 cellule / ml), aggiungi direttamente l'anticorpo coniugato con fluoresceina per la reazione di immunolabeling (come colorazione con doppia etichetta o multietichettata, aggiungi diversi anticorpi marcati con fluoresceina diversa allo stesso tempo), incuba Dopo 20 a 60 minuti, lavare con PBS (pH da 7,2 a 7,4) per 1 o 2 volte, risospendere in tampone e testare sulla macchina. Il metodo presenta i vantaggi di un funzionamento semplice, risultati accurati e analisi facili ed è adatto per la determinazione simultanea di più parametri dello stesso gruppo di cellule. Sebbene il costo del reagente anticorpale marcato direttamente sia elevato, riduce l'interferenza di una forte fluorescenza non specifica nel metodo di etichettatura indiretta, e quindi è più adatto per la rilevazione di campioni clinici. (due) etichettatura indiretta di immunofluorescenza Prendi una certa quantità di sospensione cellulare (circa 1X106 cellule / ml), prima aggiungi un primo anticorpo specifico, lava l'anticorpo non legato dopo il completamento della reazione, quindi aggiungi un anticorpo secondario marcato con fluorescenza per formare un complesso antigene-anticorpo-anticorpo FCM rileva la fluorescenza emessa dalla fluoresceina marcata dopo che è stata eccitata. Il metodo è a basso costo e l'anticorpo secondario è ampiamente utilizzato e viene utilizzato principalmente per il rilevamento di campioni scientifici. Tuttavia, poiché l'anticorpo secondario è generalmente un anticorpo policlonale, la specificità è scarsa e lo sfondo fluorescente non specifico è forte, il che influenza facilmente i risultati sperimentali. Pertanto, un controllo negativo o positivo deve essere aggiunto alla preparazione del campione. Inoltre, a causa dell'elevato numero di passaggi nel metodo di etichettatura standard, la perdita di cellule è aumentata e non è adatto per misurare campioni con un piccolo numero di cellule. Non adatto alla folla Nessuno.