Rilevazione immunologica di Helicobacter pylori

I test immunologici dell'Helicobacter pylori rilevano l'infezione da H. pylori misurando gli anticorpi dell'Helicobacter pylori nel siero, inclusi saggi di emoagglutinazione passiva, tecniche di immunoblotting e saggi di immunoassorbimento enzimatici (ELISA). Il paziente prese il liquido cerebrospinale e diluì l'antigene con la piastra di emoagglutinazione di tipo V a 96 pozzetti per diluire l'antigene JE, in modo che ciascun pozzetto contenesse 25 uL e il siero da testare fosse diluito 1:10 ad ogni diluizione. Aggiungi 25uL, aggiungi anticorpo monoclonale cerebrale liofilizzato per sensibilizzare i globuli rossi di pecora 25uL e osserva i risultati dopo essere rimasto a 37 ° C per diverse ore. Informazioni di base Classificazione specialistica: classificazione dell'esame di crescita e sviluppo: esame del sangue Genere applicabile: se uomini e donne applicano il digiuno: il digiuno Suggerimenti: mantenere a stomaco vuoto dall'esame. Valore normale Il risultato è stato negativo. Significato clinico Risultati anormali: 1. Il titolo di agglutinazione sierica del test è 4 volte o più di 4 volte superiore al controllo dell'antigene. Il titolo di antigene sierico durante il periodo di recupero era 4 o più volte superiore alla fase acuta ed era positivo. 2. Esiste una reazione cromatica speciale, che dimostra l'esistenza di una determinata proteina. 3. Il rapporto tra il siero da testare e il siero negativo noto (P / N) ≥ 2,1 e il valore di OD del siero da testare è ≥ 0,4, quindi viene giudicato positivo. Necessità di controllare la folla: pazienti con ulcera peptica. precauzioni Controindicazioni prima dell'ispezione: prestare attenzione alla protezione del cervello; preparare vari liquidi di imballaggio e configurare la concentrazione. Tabù durante il controllo: 1. Il paziente prende il liquido cerebrospinale per sedersi, in modo da non ferire la testa. 2. Anticorpi monoclonali usati per sensibilizzare i globuli rossi di pecora da liofilizzare prima dell'uso. 3. La diluizione, la durata dell'azione e la temperatura degli anticorpi primari e secondari devono essere pre-sperimentate per determinare le condizioni ottimali per le diverse proteine. 4. La soluzione di sviluppo del colore deve essere appena configurata e infine aggiunta a H2O2. 5. DAB ha il potenziale per causare il cancro, quindi fai attenzione quando lo maneggi. 6. Controllare rigorosamente i fattori che influenzano l'efficienza dell'etichettatura come temperatura, tempo, pH, enzima e quantità di anticorpi. 7. Quando si installa la colonna, rendere uniforme la colonna, la superficie del cilindro è piatta e non ci sono bolle o crepe. Processo di ispezione In primo luogo, coagulazione del sangue passivo Il paziente prese il liquido cerebrospinale e diluì l'antigene con la piastra di emoagglutinazione di tipo V a 96 pozzetti per diluire l'antigene JE, in modo che ciascun pozzetto contenesse 25 uL e il siero da testare fosse diluito 1:10 ad ogni diluizione. Aggiungere 25 uL e aggiungere 25 uL di globuli rossi di pecora sensibilizzati dall'anticorpo monoclonale cerebrale liofilizzato e osservare i risultati dopo essere rimasti a 37 ° C per diverse ore. In secondo luogo, la tecnologia di immunoblotting (A) campione proteico ottenuto: dopo induzione batterica dell'espressione, le cellule possono essere lisate direttamente mediante tampone di caricamento per elettroforesi, cellule eucariotiche più tampone di omogeneizzazione, omogenato meccanico o ultrasonico a temperatura ambiente 0,5-1min. È stato quindi centrifugato a 13.000 g per 15 minuti a 4 ° C. Prendi il surnatante come campione. (2) Elettroforesi: è stato preparato un gel per elettroforesi e sottoposto a SDS-PAGE. (3) Trasferimento: (trasferimento semi-asciutto) 1. Al termine dell'elettroforesi, tagliare la striscia della dimensione appropriata ed equilibrare con il tampone di membrana, 5 min × 3 volte. 2. Trattamento della membrana: la carta da filtro e la membrana NC delle stesse dimensioni della striscia sono state pretagliate e immerse nel tampone di trasferimento per 10 minuti. 3. Pellicola di trasferimento: il dispositivo di trasferimento di pellicola viene posizionato in ordine dal basso verso l'alto secondo l'ordine della lastra di carbone anodico, 24 strati di carta da filtro, pellicola NC, gel, 24 strati di carta da filtro e piastra di carbone catodico. La carta da filtro, il gel e la pellicola NC sono allineati con precisione. Le bolle sono state rimosse in una fase e ad esse è stato applicato un peso di 500 g per asciugare il liquido in eccesso sulla piastra di carbonio. Accendere l'alimentazione, corrente costante 1mA / cm2, trasferire 1,5 ore. Al termine del trasferimento, l'alimentazione viene rimossa e la membrana viene rimossa e la striscia da testare viene tagliata per l'immunoblotting. Le strisce standard proteiche sono state colorate, poste nella soluzione di colorazione della membrana per 50 secondi, quindi decolorate più volte al 50% in metanolo su uno sfondo chiaro, quindi lavate con acqua distillata doppia, asciugate all'aria in due strati di carta da filtro e lasciate a colore I risultati vengono confrontati. (4) Risposta immunitaria: 1. Lavare la membrana con 0,01 M PBS per 5 minuti x 3 volte. 2. Aggiungere la soluzione di rivestimento e agitare delicatamente a temperatura ambiente per 2 ore. 3. Eliminare la soluzione e lavare la membrana con 0,01 M PBS per 5 minuti × 3 volte. 4. Aggiungere l'anticorpo primario (diluito con 0,01 M PBS in un rapporto di diluizione adeguato, il liquido deve coprire tutta la membrana) e lasciare a 4 ° C per più di 12 ore. Nel controllo negativo, l'anticorpo primario è stato sostituito con l'1% di BSA e i passaggi rimanenti erano gli stessi del gruppo sperimentale. 5. Eliminare l'anticorpo primario e l'1% di BSA e lavare la membrana con 0,01 M PBS, 5 min × 4 volte. 6. Aggiungere l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (diluito con 0,01 M PBS al rapporto di diluizione appropriato) e agitare delicatamente per 2 ore a temperatura ambiente. 7. Eliminare l'anticorpo secondario e lavare la membrana con 0,01 M PBS per 5 minuti × 4 volte. 8. Aggiungi la soluzione colorante, evita la luce e sviluppa il colore fino a quando appare la banda.Inserisci la doppia acqua distillata per fermare la reazione. In terzo luogo, determinazione di adsorbimento combinata enzimatica I metodi ELISA comunemente usati includono un metodo sandwich a doppio anticorpo e un metodo indiretto, il primo per rilevare gli antigeni macromolecolari e il secondo per misurare specifici anticorpi. ELISA indiretto Questo metodo viene utilizzato principalmente per rilevare anticorpi. La procedura per ELISA indiretto è la seguente. (1) Materiali 1 liquido di rivestimento, liquido di lavaggio, liquido di conservazione del calore, liquido di substrato e liquido di arresto; Antigene rivestito 2DVH, anticorpo marcato con enzima, siero di riferimento DVH negativo e positivo; 3 rivelatore ELISA, campionatore, micropiastra in polistirene. (2) Passaggi del metodo 1 più rivestimento antigene → 4 ° C durante la notte, lavato tre volte, gettato a secco; 2 più siero da testare → 37 ° C per 2 ore, lavato tre volte, gettato a secco; 3 più anticorpo marcato con enzima → 37 ° C per 2 ore, lavato tre volte, gettato a secco; 4 aggiungere la soluzione di substrato → 37 ° C per 30 minuti, aggiungere la soluzione di arresto; 5 Il valore OD è stato misurato da un rivelatore ELISA ed è stato calcolato il rapporto P / N. 2. ELISA sandwich doppio anticorpo Questo metodo viene utilizzato principalmente per rilevare antigeni macromolecolari. 1 più rivestimento anticorpale → 4 ° C durante la notte, lavato tre volte, gettato a secco; 2 più l'antigene da testare → 37 ° C per 30 minuti, lavato tre volte, gettato a secco; 3 più anticorpo marcato con enzima → 37 ° C per 30 minuti, lavato tre volte, gettato a secco; 4 aggiungere la soluzione di substrato → 37 ° C per 15 minuti, aggiungere la soluzione di arresto; 5 Il valore OD è stato misurato da un tester ELISA. Non adatto alla folla Non adatto per controllare la folla: nessuno. Reazioni e rischi avversi Nessuna complicanza o rischio correlato.