Isolamento e Identificação de Bactérias Anaeróbias

O isolamento e identificação de bactérias anaeróbias é um teste para a separação e identificação de bactérias com alta sensibilidade ao oxigênio.Como microorganismos anaeróbios são amplamente distribuídos na natureza e têm uma ampla variedade, suas funções fisiológicas têm recebido atenção crescente. As bactérias anaeróbias obrigatórias são muito sensíveis ao oxigênio, portanto, a chave para sua separação, cultura e contagem viável é fornecer um ambiente de cultura livre de oxigênio e baixo potencial redox. Informação básica Classificação especializada: classificação de verificação de crescimento e desenvolvimento: exame bioquímico Sexo aplicável: se homens e mulheres aplicam jejum: jejum Dicas: Se a colônia é muito pequena, use uma lupa para observar as colônias. Valor normal O tipo e a proporção da flora no corpo são normais e o corpo humano está em estado de equilíbrio dinâmico e saúde. Significado clínico Tecnologia de tubo de rolamento anaeróbico de Hengate, a tecnologia de tubo de rolamento anaeróbio de Hengate é uma tecnologia de cultura anaeróbica proposta pela primeira vez pelo microbiologista americano Hengate em 1950 e aplicada à pesquisa de microrganismos anaeróbicos no rúmen. Resultados anormais: doenças especiais causadas por anaeróbios de Clostridium, como gangrena gasosa, tétano, botulismo, etc. Pessoas que precisam ser examinadas: pacientes com diabetes, doença hepática grave, cirrose, uremia, úlcera hemorróida, gangrena de membros, botulismo e outros sintomas. Precauções No processo de separação e identificação de bactérias anaeróbias, as seguintes questões devem ser observadas: (1) As amostras anaeróbicas devem ser isoladas do ar durante a coleta e o transporte e devem ser completadas em 30 minutos, evitando a contaminação da flora normal. (2) O meio deve ser preparado na hora, se for armazenado por muito tempo, o oxigênio é dissolvido na superfície ou o peróxido está no meio, o que não é propício para o crescimento de bactérias anaeróbicas. (3) Se a colônia é muito pequena, a colônia deve ser observada com uma lupa. (4) Para realizar um teste de tolerância ao oxigênio, é necessário coletar de 4 a 5 colônias de diferentes características de cada placa de ágar, inocular placas de ágar de sangue aeróbio e anaeróbio e colocá-las em ambientes aeróbicos, de dióxido de carbono e anaeróbicos. (5) Se você faz a identificação de enzimas extracelulares, você deve ter concentração bacteriana suficiente. Processo de inspeção Separação (1) número Pegue cinco tubos estéreis de água e marque-os com um marcador para indicar 10-1, 10-2, ... 10-5. (2) diluição Em um porta-luvas anaeróbico ultra-limpo estéril, use uma seringa estéril para extrair 1 mL de uma amostra líquida bem misturada, adicione-a a um tubo de teste anaeróbico contendo soro fisiológico pré-reduzido e misture-a uniformemente com um oscilador. Faça uma diluição de 10-1. Uma pipeta de 1 mL 10-1 foi pipetada para um tubo anaeróbico separado contendo 9 mL de soro fisiológico usando uma seringa estéril para fazer uma diluição de 10-2. Diluído em série 10 vezes a 10-6 para fazer diferentes diluições da amostra. A contagem de tubos é geralmente selecionada por três diluições de 10-4, 10-5 e 10-6. (3) separação do rolo 1) tubo de rolamento O meio de ágar anaeróbico estéril foi dissolvido num banho de água a ferver, colocado num banho de água a uma temperatura constante de 46-50 ° C e utilizado e, quando o meio foi retirado do frasco, foi insuflado com N2 no meio. Em seguida, inflar com N2 no tubo de ensaio, remover todo o ar dentro do tubo, em seguida, adicione o meio ao tubo e ligue imediatamente a rolha. Quando a tampa é inserida no tubo, a agulha de inflação é retirada a tempo. Pipete 0,1 mL de cada uma das diluições de 10-4, 10-5 e 10-6 em um tubo de ensaio a ser usado e, em seguida, coloque-o em uma placa de porcelana contendo água gelada e role rapidamente. O agar solubilizado forma uma camada solidificada imediatamente na parede interna do tubo de ensaio. 2) Separação e purificação As colônias resultantes precisam ser colhidas e examinadas quanto à sua morfologia e pureza. Se uma cultura pura não tiver sido obtida, dilua o tubo novamente e escolha o cólon novamente até que uma cultura pura seja obtida. As únicas colônias a serem colhidas são preliminarmente observadas sob uma lupa e marcadas. O tubo de ensaio médio é então fixado a um suporte adequado, e a rolha de borracha do tubo de ensaio é aberta, e uma agulha de azoto cheia com gás tendo um fluxo de ar adequado e uma bactéria morta por chama é rapidamente inserida no tubo. Ao mesmo tempo, outro tubo anaeróbico líquido é removido do bujão de borracha e inserido em outra agulha de ventilação esterilizada. Com cuidado, insira os capilares de cotovelo preparados no meio sólido, identifique as colônias a serem colhidas, aspire com cuidado, transfira-as para um tubo de ensaio líquido e tampe-as. A cultura foi cultivada a 37 ° C durante 24 horas ou mais ou após a turvação da solução de cultura ter sido verificada, e a pureza da cultura isolada foi examinada. 3) Separação do traço Uma extremidade da rolha de borracha do tubo de teste é queimada na chama e a agulha de sucção de gás é usada para tampar o bocal.Antes de a agulha ser rapidamente removida, o ar é ventilado por 15-20 s, e uma extremidade do tubo é queimada por algum tempo na chama. Aperte o bujão do tubo e o tubo enrolado é montado e isolado Use CO2: H2 = 80: 20. Como o CO2 é mais pesado que o ar, o bujão não terá resíduos de ar após a abertura. O tubo de gravação pode ser cultivado a 34-37 graus para crescer colônias. Identificação de cepas 1 teste de fermentação de açúcar Experimentos de fermentação de açúcar são as reações bioquímicas mais utilizadas e são particularmente importantes na identificação de bactérias intestinais. A maioria das bactérias pode usar açúcar como fonte de carbono e fonte de energia, mas tem grandes diferenças em sua capacidade de decompor o açúcar.Algumas bactérias podem quebrar o açúcar e produzir ácido (como ácido láctico, ácido acético, ácido propiônico, etc.) e gás (como Hidrogênio, metano, dióxido de carbono, etc, algumas bactérias produzem apenas ácido e não produzem gás. Por exemplo, Escherichia coli pode decompor lactose e glicose para produzir ácido e produzir gás, Salmonella typhimurium pode decompor glicose para produzir ácido e não produzir gás, e não pode decompor lactose, Proteus comum decompõe glicose para produzir ácido e produz gás que não pode decompor lactose. A produção de ácido pode ser determinada usando um indicador. Roxo de bromocresol [pH 5,2 (amarelo) - 6,8 (púrpura)] foi adicionado antecipadamente quando o meio foi preparado, e quando o ácido foi produzido por fermentação, o meio foi mudado de púrpura para amarelo. A geração de gás pode ser evidenciada pela presença ou ausência de bolhas no tubo de Dehan invertido no tubo de fermentação. Etapas experimentais específicas: 1 O líquido bacteriano é apropriadamente diluído e, em seguida, em um ambiente estéril, uma certa quantidade da solução diluída é injetada no tubo de identificação bioquímica e selada com uma película de selagem estéril. 2 Coloque o tubo de identificação inoculado em um tanque anaeróbico e coloque-o em uma incubadora de temperatura constante a 37 ° C com nitrogênio suficiente. A mudança de cor e a produção de gás de cada tubo foram observadas após 324 h. 2 experimento de decomposição de proteínas 1 O líquido bacteriano é apropriadamente diluído e, em seguida, em um ambiente estéril, uma certa quantidade da solução diluída é injetada no tubo de identificação bioquímica e selada com uma película de selagem estéril. 2 Coloque o tubo de identificação inoculado em um tanque anaeróbico e coloque-o em uma incubadora de temperatura constante a 37 ° C com nitrogênio suficiente. Após 324 horas, os tubos foram submetidos à reação de Mirren, à reação de hidrazina, à reação amarela e à reação de bochecho, respectivamente. Experiência de hidrólise de 3 amidos 1 O líquido bacteriano é apropriadamente diluído e, em seguida, em um ambiente estéril, uma certa quantidade da solução diluída é injetada no tubo de identificação bioquímica e selada com um filme de selagem estéril. 2 Coloque o tubo de identificação inoculado em um tanque anaeróbico e coloque-o em uma incubadora de temperatura constante a 37 ° C com nitrogênio suficiente. Após 324 h, uma quantidade apropriada de solução de Lugol foi adicionada a cada tubo para observar a hidrólise do amido. Não é adequado para a multidão Nenhuma informação relevante. Reações adversas e riscos Não foram encontradas complicações e perigos relacionados.