ซับตะวันตก

Immunoblotting เป็นการถ่ายโอนโปรตีนไปยังเยื่อหุ้มเซลล์และการตรวจสอบครั้งต่อไปโดยใช้แอนติบอดี สำหรับโปรตีนที่แสดงนั้นสามารถใช้แอนติบอดีที่สอดคล้องกันเป็นแอนติบอดีปฐมภูมิในการตรวจจับการแสดงออกของยีนใหม่สามารถตรวจพบได้โดยส่วนฟิวชั่นของแอนติบอดีและมีข้อดีของความสามารถในการวิเคราะห์ขนาดใหญ่ความไวสูงความจำเพาะสูง หนึ่งในวิธีการแสดงออกและการกระจายที่ใช้กันมากที่สุดเช่นการตรวจสอบเชิงปริมาณและเชิงปริมาณของแอนติเจนของเนื้อเยื่อการตรวจสอบมวลของโมเลกุลโพลีเปปไทด์และการตรวจหาแอนติบอดีหรือแอนติเจนของไวรัส ข้อมูลพื้นฐาน การจำแนกผู้เชี่ยวชาญ: การจำแนกประเภทการเจริญเติบโตและการพัฒนา: การตรวจสอบทางชีวเคมี เพศที่ใช้บังคับ: ไม่ว่าจะเป็นผู้ชายและผู้หญิงใช้การอดอาหาร: ไม่อดอาหาร เคล็ดลับ: ปฏิบัติตามคำแนะนำของแพทย์ ค่าปกติ ไม่มีปฏิกิริยาสีพิเศษ ความสำคัญทางคลินิก ผลลัพธ์ที่ผิดปกติ: มีปฏิกิริยาสีพิเศษซึ่งพิสูจน์ว่ามีโปรตีนอยู่ จำเป็นต้องตรวจสอบฝูงชน: ตรวจสอบโปรตีนบางอย่าง ข้อควรระวัง ข้อห้ามเมื่อตรวจสอบ: ไม่มี ข้อห้ามเมื่อตรวจสอบ: 1. การเจือจางเวลาดำเนินการและอุณหภูมิของแอนติบอดีปฐมภูมิและแอนติบอดีทุติยภูมิจะถูกกำหนดโดยการทดลองล่วงหน้าเพื่อกำหนดเงื่อนไขที่เหมาะสมสำหรับโปรตีนต่างๆ 2. โซลูชันการพัฒนาสีจะต้องกำหนดค่าและใช้งานใหม่และสุดท้ายจะเพิ่ม H2O2 3 DAB มีศักยภาพในการก่อมะเร็งให้ระมัดระวังเมื่อใช้งาน กระบวนการตรวจสอบ (A) ตัวอย่างโปรตีนที่ได้รับ: หลังจากการเหนี่ยวนำแบคทีเรียของการแสดงออกเซลล์สามารถ lysed โดยตรงโดยโหลดอิเล็กโทรโฟเรเซลล์เซลล์ยูคาริโอตบวกบัฟเฟอร์ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันอุณหภูมิห้องกลหรืออัลตราโซนิก homogenate 0.5-1 นาที จากนั้นก็หมุนเหวี่ยงที่ 13,000 กรัมเป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 ° C นำส่วนเหนือตัวอย่างมาเป็นตัวอย่าง (2) อิเล็กโตรโฟรีซิส: เจลอิเล็กโตรโฟรีซิสได้ถูกเตรียมและถูกจัดทำขึ้นภายใต้ระบบ SDS (3) การถ่ายโอน: (การถ่ายโอนกึ่งแห้ง) 1. หลังจากเสร็จสิ้นการ electrophoresis ตัดแถบให้มีขนาดที่เหมาะสมและปรับสมดุลด้วยบัฟเฟอร์เมมเบรน 5 นาที× 3 ครั้ง 2. การบำบัดด้วยเมมเบรน: กระดาษกรองและเมมเบรน NC ที่มีขนาดเดียวกับแถบถูกตัดและแช่ในบัฟเฟอร์การถ่ายโอนเป็นเวลา 10 นาที 3. ฟิล์มถ่ายโอน: ฟิล์มถ่ายโอนอุปกรณ์จะถูกจัดเรียงตามลำดับจากด้านล่างขึ้นบนตามลำดับของแผ่นขั้วบวกคาร์บอนกระดาษกรอง 24 ชั้นฟิล์ม NC แผ่นเจลแผ่นกระดาษกรอง 24 ชั้นและแผ่นคาร์บอนแคโทดแผ่นกระดาษกรองเจลและแผ่นฟิล์ม NC ถูกจัดเรียงอย่างแม่นยำ ฟองสบู่ถูกกำจัดออกไปในขั้นตอนเดียวและมีน้ำหนัก 500 กรัมนำไปใช้เพื่อทำให้ของเหลวส่วนเกินบนแผ่นคาร์บอนแห้ง เปิดพลังงานคงที่ในปัจจุบัน 1mA / cm2 ถ่ายโอน 1.5hr หลังจากการถ่ายโอนเสร็จสิ้นพลังจะถูกลบและเมมเบรนจะถูกนำออกและแถบที่จะถูกทดสอบจะถูกตัดเพื่อหาภูมิคุ้มกัน แถบมาตรฐานโปรตีนถูกย้อมสีวางไว้ในสารละลายการย้อมสีเมมเบรนเป็นเวลา 50 วินาทีและจากนั้นทำให้สีในเมทิลแอลกอฮอล์ 50% หลายครั้งไปยังพื้นหลังที่ชัดเจนจากนั้นล้างด้วยน้ำกลั่นสองครั้งเป่าให้แห้งด้วยกระดาษกรองสองชั้น ผลการเปรียบเทียบ (4) การตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน: 1. ล้างเมมเบรนด้วย 0.01 M PBS เป็นเวลา 5 นาที x 3 ครั้ง 2. เพิ่มน้ำยาเคลือบผิวและเขย่าเบา ๆ ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง 3. ทิ้งสารละลายและล้างเมมเบรนด้วย 0.01 M PBS เป็นเวลา 5 นาที× 3 ครั้ง 4. เพิ่มแอนติบอดีปฐมภูมิ (เจือจางด้วย 0.01 M PBS ในอัตราส่วนการเจือจางที่เหมาะสมของเหลวจะต้องครอบคลุมเมมเบรนทั้งหมด) และทิ้งไว้ที่ 4 ° C นานกว่า 12 ชั่วโมง ในการควบคุมเชิงลบแอนติบอดีปฐมภูมิจะถูกแทนที่ด้วย 1% บีเอสเอและขั้นตอนที่เหลือเหมือนกันในกลุ่มการทดลอง 5. ทิ้งแอนติบอดีปฐมภูมิและ 1% บีเอสเอและล้างเยื่อด้วย 0.01 M PBS, 5 นาที× 4 ครั้ง 6. เพิ่มแอนติบอดี้ทุติยภูมิพืชชนิดหนึ่ง peroxidase-conjugated (เจือจางด้วย 0.01 M PBS ในอัตราส่วนเจือจางที่เหมาะสม) และเขย่าเบา ๆ เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง 7. ทิ้งแอนติบอดีรองและล้างเยื่อด้วย 0.01 M PBS เป็นเวลา 5 นาที× 4 ครั้ง 8. เพิ่มสารละลายสีหลีกเลี่ยงแสงและพัฒนาสีจนกระทั่งแถบสีปรากฏขึ้นใส่ในน้ำกลั่นสองครั้งเพื่อหยุดปฏิกิริยา ไม่เหมาะกับฝูงชน ไม่เหมาะสำหรับฝูงชน: ไม่ ปฏิกิริยาและความเสี่ยงที่ไม่พึงประสงค์ ไม่มีภาวะแทรกซ้อนหรืออันตรายที่เกี่ยวข้อง