Western blotting

Immunoblotting er overførslen af ​​proteiner til en membran og efterfølgende detektion ved anvendelse af antistoffer. For det kendte udtrykte protein kan det tilsvarende antistof anvendes som det primære antistof til påvisning Ekspressionsproduktet af det nye gen kan detekteres af fusionsdelen af ​​antistoffet og har fordelene ved stor analytisk kapacitet, høj følsomhed, stærk specificitet osv. En af de mest almindeligt anvendte metoder til ekspression og distribution, såsom kvalitativ og kvantitativ detektion af vævsantigener, massebestemmelse af polypeptidmolekyler og påvisning af antistoffer eller antigener af vira. Grundlæggende information Specialistklassificering: vækst og udviklingskontrolklassificering: biokemisk undersøgelse Gældende køn: om mænd og kvinder anvender faste: ikke faste Tip: Overhold lægenes instruktioner. Normal værdi Ingen særlig farvereaktion. Klinisk betydning Unormale resultater: Der er en speciel farvereaktion, der beviser, at der findes et bestemt protein. Brug for at kontrollere mængden: Kontroller for et bestemt protein. Forholdsregler Tabu ved kontrol: Ingen. Tabu ved kontrol: 1. Fortynding, virkningstid og temperatur for det primære antistof og det sekundære antistof bestemmes ved foreksperiment for at bestemme de optimale betingelser for forskellige proteiner. 2. Farveudviklingsopløsningen skal konfigureres og bruges frisk, og endelig tilføjes H2O2. 3, DAB har potentialet for kræftfremkaldende egenskaber, vær forsigtig ved håndtering. Inspektionsproces (A) opnået proteinprøve: efter bakteriel induktion af ekspression kan cellerne lysiseres direkte ved hjælp af elektroforese-ladningsbuffer, eukaryotiske celler plus homogeniseringsbuffer, mekanisk eller ultralyd stuetemperaturhomogenat 0,5-1min. Det blev derefter centrifugeret ved 13.000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Tag supernatanten som en prøve. (2) Elektroforese: En elektroforesegel blev fremstillet og underkastet SDS-PAGE. (3) Transfer: (semi-dry transfer) 1. Når elektroforesen er færdig, skal du skære strimlen til den passende størrelse og ækvilibrere med membranbufferen, 5 minutter × 3 gange. 2. Membranbehandling: Filterpapiret og NC-membranen i samme størrelse som strimlen blev forudskåret og nedsænket i overførselsbufferen i 10 minutter. 3. Overførselsfilm: Filmoverførselsindretningen placeres i rækkefølge fra bund til top i henhold til rækkefølgen af ​​anode-carbonplade, 24 lag filterpapir, NC-film, gel, 24 lag filterpapir og katode-carbonplade. Filterpapir, gel og NC-film er præcist på linje. Boblerne blev fjernet i et trin, og en vægt på 500 g blev påført derpå for at tørre overskydende væske på carbonpladen. Tænd for strømmen, konstant strøm 1mA / cm2, overfør 1,5 time. Når overførslen er afsluttet, fjernes kraften, og membranen fjernes, og strimlen, der skal testes, skæres til immunblotting. Proteinstandardstrimlerne blev farvet, anbragt i membranfarvningsopløsningen i 50 s og derefter affarvet i 50% methanol flere gange til en klar baggrund, derefter vasket med dobbeltdestilleret vand, lufttørret i to lag filterpapir og overladt til farve Resultaterne sammenlignes. (4) Immunrespons: 1. Vask membranen med 0,01 M PBS i 5 minutter x 3 gange. 2. Tilsæt coatingopløsningen og ryst forsigtigt ved stuetemperatur i 2 timer. 3. Bortskaf opløsningen, og vask membranen med 0,01 M PBS i 5 minutter × 3 gange. 4. Tilsæt primært antistof (fortyndet med 0,01 M PBS i et passende fortyndingsforhold, væsken skal dække hele membranen) og lade stå ved 4 ° C i mere end 12 timer. I den negative kontrol blev det primære antistof erstattet med 1% BSA, og de resterende trin var de samme som i den eksperimentelle gruppe. 5. Kasser det primære antistof og 1% BSA, og vask membranen med 0,01 M PBS, 5 min × 4 gange. 6. Tilsæt peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (fortyndet med 0,01 M PBS ved det passende fortyndingsforhold) og ryst forsigtigt i 2 timer ved stuetemperatur. 7. Kasser det sekundære antistof, og vask membranen med 0,01 M PBS i 5 minutter × 4 gange. 8. Tilsæt farveløsningen, undgå lyset og udvikl farve, indtil båndet vises. Sæt det dobbeltdestillerede vand i for at stoppe reaktionen. Ikke egnet til mængden Ikke egnet til mængden: nej. Bivirkninger og risici Ingen relaterede komplikationer eller farer.