Aislamiento e identificación de bacterias anaerobias

El aislamiento e identificación de bacterias anaerobias es una prueba para la separación e identificación de bacterias con alta sensibilidad al oxígeno. Debido a que los microorganismos anaerobios están ampliamente distribuidos en la naturaleza y tienen una amplia variedad, sus funciones fisiológicas han recibido una atención creciente. Las bacterias anaerobias obligatorias son muy sensibles al oxígeno, por lo que la clave para su separación, cultivo y conteo viable es proporcionar un ambiente de cultivo libre de oxígeno y bajo potencial redox. Información básica Clasificación de especialistas: clasificación de verificación de crecimiento y desarrollo: examen bioquímico Género aplicable: si los hombres y las mujeres aplican el ayuno: ayuno Consejos: si la colonia es demasiado pequeña, use una lupa para observar las colonias. Valor normal El tipo y la proporción de la flora en el cuerpo son normales, y el cuerpo humano se encuentra en un estado de equilibrio dinámico y salud. Importancia clínica Tecnología de tubo rodante anaeróbico de Hengate, la tecnología de tubo rodante anaeróbico de Hengate es una tecnología de cultivo anaeróbico propuesta por primera vez por el microbiólogo estadounidense Hengate en 1950 y aplicada a la investigación de microorganismos anaerobios en el rumen. Resultados anormales: enfermedades especiales causadas por anaerobios de Clostridium como gangrena gaseosa, tétanos, botulismo, etc. Personas que necesitan ser examinadas: pacientes con diabetes, enfermedad hepática grave, cirrosis, uremia, úlceras hemorroides, gangrena de extremidades, botulismo y otros síntomas. Precauciones En el proceso de separación e identificación de bacterias anaerobias, deben tenerse en cuenta los siguientes asuntos: (1) Las muestras anaeróbicas deben aislarse del aire durante la recolección y el transporte, y deben completarse en 30 minutos, evitando la contaminación de la flora normal. (2) El medio debe estar recién preparado. Si se almacena durante demasiado tiempo, el oxígeno se disuelve en la superficie o el peróxido está en el medio, lo que no es propicio para el crecimiento de bacterias anaerobias. (3) Si la colonia es demasiado pequeña, la colonia debe observarse con una lupa. (4) Para realizar una prueba de tolerancia al oxígeno, se requiere seleccionar de 4 a 5 colonias de diferentes rasgos de cada placa de agar, inocular placas de agar sangre sanguíneas aeróbicas y anaeróbicas, y colocarlas en ambientes aeróbicos, de dióxido de carbono y anaeróbicos. (5) Si realiza una identificación enzimática extracelular, debe tener una concentración bacteriana suficiente. Proceso de inspección Separación (1) número Tome cinco tubos de agua estériles y márquelos con un marcador para indicar 10-1, 10-2, ... 10-5. (2) dilución En una guantera anaeróbica ultra limpia y estéril sin oxígeno, use una jeringa estéril para extraer 1 ml de una muestra líquida bien mezclada, agréguela a un tubo de ensayo anaeróbico que contenga solución salina fisiológica previamente reducida y mezcle uniformemente con un oscilador. Hacer una dilución 10-1. Se pipeteó una dilución 10-1 de 1 ml en un tubo anaeróbico separado que contenía 9 ml de solución salina fisiológica usando una jeringa estéril para hacer una dilución 10-2. Diluido en serie por 10 veces a 10-6 para hacer diferentes diluciones de muestra. El recuento de tubos generalmente se selecciona mediante tres diluciones de 10-4, 10-5 y 10-6. (3) separación de rodillos 1) tubo rodante El medio de agar estéril anaeróbico se disolvió en un baño de agua hirviendo, se colocó en un baño de agua a una temperatura constante de 46-50 ° C y se usó, y cuando se sacó el medio de la botella, se infló con N 2 en el medio. Luego infle con N2 en el tubo de ensayo, elimine todo el aire dentro del tubo, luego agregue el medio al tubo e inmediatamente tape el tapón. Cuando se inserta el tapón en el tubo, la aguja de inflado se saca a tiempo. Pipetee 0.1 mL de cada una de las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 en un tubo de ensayo que se utilizará, y luego colóquelo sobre una placa de porcelana que contenga agua helada y ruede rápidamente. El agar solubilizado forma una capa solidificada inmediatamente en la pared interna del tubo de ensayo. 2) Separación y purificación. Las colonias resultantes deben seleccionarse y examinarse por su morfología y pureza. Si no se ha obtenido un cultivo puro, diluya nuevamente el tubo y recoja el colon nuevamente hasta obtener un cultivo puro. Las colonias individuales que se recogerán se observan preliminarmente bajo una lupa y se marcan. Luego, el tubo de ensayo mediano se fija a un soporte adecuado, y se abre el tapón de goma del tubo de ensayo, y se inserta rápidamente una aguja de nitrógeno llena de gas que tiene un flujo de aire adecuado y una bacteria eliminada por llama en el tubo. Al mismo tiempo, otro tubo anaeróbico líquido se retira del tapón de goma y se inserta en otra aguja de ventilación esterilizada. Inserte cuidadosamente los capilares del codo preparados en el medio sólido, identifique las colonias que se van a recoger, aspírelos suavemente, transfiéralos a un tubo de ensayo líquido y tapón. El cultivo se cultivó a 37 ° C durante 24 horas o más o después de comprobar la turbidez de la solución de cultivo y examinar la pureza del cultivo aislado. 3) separación del tablero Un extremo del tapón de goma del tubo de ensayo se quema en la llama, y ​​la aguja de succión de gas se usa para tapar la boquilla. Antes de retirar rápidamente la aguja, el aire se ventila durante 15-20 s, y un extremo del tubo se quema durante un tiempo en la llama. Apriete el tapón de la tubería, y la tubería enrollada se erigirá y aislará. Utilice CO2: H2 = 80: 20. Como el CO2 es más pesado que el aire, el tapón de la tubería no tendrá residuos de aire después de abrirse. El tubo de trazado se puede cultivar a 34-37 grados para cultivar colonias. Identificación de cepas 1 prueba de fermentación de azúcar Los experimentos de fermentación de azúcar son las reacciones bioquímicas más utilizadas y son particularmente importantes en la identificación de bacterias intestinales. La mayoría de las bacterias pueden usar el azúcar como fuente de carbono y fuente de energía, pero tienen grandes diferencias en su capacidad para descomponer el azúcar. Algunas bacterias pueden descomponer el azúcar y producir ácido (como ácido láctico, ácido acético, ácido propiónico, etc.) y gas (como Hidrógeno, metano, dióxido de carbono, etc., algunas bacterias producen solo ácido y no producen gas. Por ejemplo, Escherichia coli puede descomponer la lactosa y la glucosa para producir ácido y producir gas; Salmonella typhimurium puede descomponer la glucosa para producir ácido y no producir gas, y no puede descomponer la lactosa; Proteus común descompone la glucosa para producir ácido y produce gas, que no puede descomponer la lactosa. La producción de ácido se puede determinar usando un indicador. El bromocresol púrpura [pH 5.2 (amarillo) - 6.8 (púrpura)] se añadió de antemano cuando se preparó el medio, y cuando el ácido se produjo por fermentación, el medio se cambió de púrpura a amarillo. La generación de gas puede evidenciarse por la presencia o ausencia de burbujas en el tubo invertido de Dehan en el tubo de fermentación. Pasos experimentales específicos: 1 El líquido bacteriano se diluye adecuadamente y luego, en un ambiente estéril, se inyecta una cierta cantidad de la solución diluida en el tubo de identificación bioquímica y se sella con una película de sellado estéril. 2 Coloque el tubo de identificación inoculado en un tanque anaeróbico y colóquelo en una incubadora de temperatura constante a 37 ° C con suficiente nitrógeno. El cambio de color y la producción de gas de cada tubo se observaron después de 324 h. Experimento de descomposición de 2 proteínas 1 El líquido bacteriano se diluye adecuadamente y luego, en un ambiente estéril, se inyecta una cierta cantidad de la solución diluida en el tubo de identificación bioquímica y se sella con una película de sellado estéril. 2 Coloque el tubo de identificación inoculado en un tanque anaeróbico y colóquelo en una incubadora de temperatura constante a 37 ° C con suficiente nitrógeno. Después de 324 horas, los tubos se sometieron a la reacción de Mirren, la reacción de hidrazina, la reacción amarilla y la reacción de enjuague bucal, respectivamente. Experimento de hidrólisis de 3 almidones 1 El líquido bacteriano se diluye adecuadamente y luego, en un ambiente estéril, se inyecta una cierta cantidad de la solución diluida en el tubo de identificación bioquímica y se sella con una película de sellado estéril. 2 Coloque el tubo de identificación inoculado en un tanque anaeróbico y colóquelo en una incubadora de temperatura constante a 37 ° C con suficiente nitrógeno. Después de 324 h, se añadió una cantidad apropiada de solución de yodo de Lugol a cada tubo para observar la hidrólisis del almidón. No apto para la multitud. No hay información relevante. Reacciones adversas y riesgos No se han encontrado complicaciones y riesgos relacionados.