Isolement et identification des bactéries anaérobies

L’isolement et l’identification des bactéries anaérobies constituent un test de séparation et d’identification des bactéries extrêmement sensibles à l’oxygène, car les microorganismes anaérobies étant très répandus dans la nature et très variés, leurs fonctions physiologiques ont fait l’objet d’une attention croissante. Les bactéries anaérobies obligatoires étant très sensibles à l'oxygène, la clé de la séparation, de la culture et du dénombrement viable est de fournir un environnement de culture sans oxygène et à faible potentiel rédox. Informations de base Classification de spécialiste: classification de contrôle de croissance et de développement: examen biochimique Sexe applicable: si les hommes et les femmes appliquent le jeûne: le jeûne Conseils: Si la colonie est trop petite, utilisez une loupe pour observer les colonies. Valeur normale Le type et la proportion de la flore dans le corps sont normaux et le corps humain est dans un état d'équilibre et de santé dynamiques. Signification clinique La technologie des tubes à roulement anaérobies Hengate est une technologie de culture anaérobie proposée pour la première fois par le microbiologiste américain Hengate en 1950 et appliquée à la recherche sur les micro-organismes anaérobies dans le rumen. Résultats anormaux: maladies particulières causées par les anaérobies de Clostridium, telles que la gangrène gazeuse, le tétanos, le botulisme, etc. Personnes devant être examinées: patients atteints de diabète, de maladie grave du foie, de cirrhose, d’urémie, d’ulcères hémorroïdaires, de gangrène des membres, de botulisme et d’autres symptômes. Précautions Lors du processus de séparation et d’identification des bactéries anaérobies, il convient de noter les points suivants: (1) Les échantillons anaérobies doivent être isolés de l'air lors de la collecte et du transport et doivent être complétés dans un délai de 30 minutes tout en évitant la contamination de la flore normale. (2) Le milieu doit être fraîchement préparé. S'il est stocké trop longtemps, de l'oxygène est dissous à la surface ou du peroxyde est dans le milieu, ce qui n'est pas propice à la croissance de bactéries anaérobies. (3) Si la colonie est trop petite, la colonie doit être observée à la loupe. (4) Pour effectuer un test de tolérance à l'oxygène, il est nécessaire de sélectionner 4 à 5 colonies de caractères différents dans chaque boîte de gélose, d'inoculer des plaques de gélose au sang aérobie et anaérobie, et de les placer dans des environnements aérobie, dioxyde de carbone et anaérobie. (5) Si vous effectuez une identification extracellulaire, vous devez avoir une concentration bactérienne suffisante. Processus d'inspection La séparation (1) nombre Prenez cinq tubes d'eau stérile et marquez-les avec un marqueur pour indiquer 10-1, 10-2, ... 10-5. (2) dilution Dans une boîte à gants anaérobie ultra-propre stérile sans oxygène, utilisez une seringue stérile pour prélever 1 ml d'un échantillon de liquide bien mélangé, ajoutez-le à un tube à essai anaérobie contenant du sérum physiologique pré-réduit et mélangez-le uniformément avec un oscillateur. Faire une dilution 10-1. Une dilution de 1 mL 10-1 a été introduite à la pipette dans un tube anaérobie séparé contenant 9 mL de solution saline physiologique en utilisant une seringue stérile pour effectuer une dilution 10-2. Dilué en série 10 fois à 10-6 pour obtenir différentes dilutions d’échantillons. Le nombre de tubes est généralement sélectionné par trois dilutions de 10-4, 10-5 et 10-6. (3) séparation des rouleaux 1) tube de roulement Le milieu de gélose anaérobie stérile a été dissous dans un bain-marie bouillant, placé dans un bain-marie à une température constante de 46-50 ° C et utilisé. Lorsque le milieu a été retiré de la bouteille, il a été gonflé à l'azote dans le milieu. Puis gonflez avec N2 dans l’éprouvette, enlevez tout l’air contenu dans l’éprouvette, puis ajoutez le liquide dans l’éprouvette et branchez immédiatement le bouchon. Lorsque le bouchon est inséré dans le tube, l'aiguille de gonflage est retirée à temps. Pipeter 0,1 ml de chacune des dilutions 10-4, 10-5 et 10-6 dans un tube à essai, puis placez-le à plat sur une assiette en porcelaine contenant de l’eau glacée et faites-le rouler rapidement. La gélose solubilisée forme une couche solidifiée immédiatement sur la paroi interne du tube à essai. 2) séparation et purification Les colonies résultantes doivent être cueillies et examinées pour déterminer leur morphologie et leur pureté. Si une culture pure n'a pas été obtenue, diluez à nouveau le tube et ramassez le côlon jusqu'à obtenir une culture pure. Les colonies isolées à prélever sont préalablement observées à la loupe et marquées. Le tube à essai de milieu est ensuite fixé à un support approprié et le bouchon en caoutchouc du tube à essai est ouvert, et une aiguille à azote remplie de gaz ayant un flux d'air adéquat et une bactérie tuée à la flamme est insérée rapidement dans le tube. En même temps, un autre tube anaérobie liquide est retiré du bouchon en caoutchouc et inséré dans une autre aiguille de ventilation stérilisée. Insérez soigneusement les capillaires coudés préparés dans le milieu solide, identifiez les colonies à cueillir, aspirez-les doucement, transférez-les dans un tube à essai liquide et fermez. La culture a été cultivée à 37 ° C pendant 24 heures ou plus, ou après vérification de la turbidité de la solution de culture, et la pureté de la culture isolée a été examinée. 3) séparation de tiret Une extrémité du bouchon en caoutchouc de l'éprouvette est brûlée sur la flamme et l'aiguille d'aspiration du gaz sert à boucher la buse.Avant de retirer rapidement l'aiguille, l'air est ventilé pendant 15 à 20 s, et une extrémité du tube est brûlée pendant un certain temps sur la flamme. Serrez le bouchon de tuyau et le tuyau enroulé est monté et isolé Utilisez CO2: H2 = 80: 20. Comme le CO2 est plus lourd que l'air, le bouchon de tuyau ne laissera pas de résidus d'air après s'être ouvert. Le tube de marquage peut être développé à 34-37 degrés pour développer des colonies. Identification des souches 1 test de fermentation du sucre Les expériences de fermentation du sucre sont les réactions biochimiques les plus couramment utilisées et sont particulièrement importantes dans l'identification des bactéries intestinales. La plupart des bactéries peuvent utiliser le sucre comme source de carbone et d’énergie, mais leur capacité à décomposer le sucre varie grandement. Certaines bactéries peuvent décomposer le sucre et produire des acides (tels que l’acide lactique, l’acide acétique, l’acide propionique, etc.) et des gaz (tels que Hydrogène, méthane, dioxyde de carbone, etc., certaines bactéries ne produisent que de l'acide et ne produisent pas de gaz. Escherichia coli peut par exemple décomposer le lactose et le glucose pour produire de l'acide et du gaz; Salmonella typhimurium peut décomposer le glucose pour produire de l'acide et non du gaz, et ne peut pas décomposer du lactose; La production d'acide peut être déterminée à l'aide d'un indicateur. Du violet de bromocrésol [pH 5,2 (jaune) - 6,8 (violet)] a été ajouté par avance lors de la préparation du milieu et lorsque l'acide a été produit par fermentation, le milieu a été changé de pourpre à jaune. La génération de gaz peut être mise en évidence par la présence ou non de bulles dans le tube de Dehan inversé dans le tube de fermentation. Étapes expérimentales spécifiques: 1 Le liquide bactérien est dilué de manière appropriée, puis dans un environnement stérile, une certaine quantité de la solution diluée est injectée dans le tube d'identification biochimique et scellée avec un film de scellement stérile. 2 Placez le tube d'identification inoculé dans un réservoir anaérobie et placez-le dans un incubateur à température constante à 37 ° C avec suffisamment d'azote. Le changement de couleur et la production de gaz de chaque tube ont été observés après 324 h. Expérience de décomposition de 2 protéines 1 Le liquide bactérien est dilué de manière appropriée, puis dans un environnement stérile, une certaine quantité de la solution diluée est injectée dans le tube d'identification biochimique et scellée avec un film de scellement stérile. 2 Placez le tube d'identification inoculé dans un réservoir anaérobie et placez-le dans un incubateur à température constante à 37 ° C avec suffisamment d'azote. Après 324 heures, les tubes ont été soumis respectivement à la réaction de Mirren, à la réaction d'hydrazine, à la réaction de jaune et à la réaction de bain de bouche. Expérience d'hydrolyse de l'amidon 3 1 Le liquide bactérien est dilué de manière appropriée, puis dans un environnement stérile, une certaine quantité de la solution diluée est injectée dans le tube d'identification biochimique et scellée avec un film de scellement stérile. 2 Placez le tube d'identification inoculé dans un réservoir anaérobie et placez-le dans un incubateur à température constante à 37 ° C avec suffisamment d'azote. Après 324 h, une quantité appropriée de solution d'iode de Lugol a été ajoutée à chaque tube pour observer l'hydrolyse de l'amidon. Ne convient pas à la foule Aucune information pertinente. Effets indésirables et risques Aucune complication ni aucun danger associés n’ont été découverts.