macchia occidentale

L'immunoblotting è il trasferimento di proteine ​​in una membrana e la successiva rilevazione mediante anticorpi. Per la proteina espressa nota, l'anticorpo corrispondente può essere utilizzato come anticorpo primario per il rilevamento. Il prodotto di espressione del nuovo gene può essere rilevato dalla parte di fusione dell'anticorpo e presenta i vantaggi di grande capacità analitica, alta sensibilità, forte specificità, ecc. Uno dei metodi di espressione e distribuzione più comunemente usati, come il rilevamento qualitativo e quantitativo di antigeni tissutali, la determinazione di massa di molecole di polipeptidi e il rilevamento di anticorpi o antigeni di virus. Informazioni di base Classificazione specialistica: classificazione del controllo di crescita e sviluppo: esame biochimico Genere applicabile: se uomini e donne applicano il digiuno: non il digiuno Suggerimenti: obbedire alle istruzioni del medico. Valore normale Nessuna reazione di colore speciale. Significato clinico Risultati anormali: esiste una reazione cromatica speciale, che dimostra l'esistenza di una determinata proteina. È necessario controllare la folla: verificare la presenza di una determinata proteina. precauzioni Tabù al momento del controllo: nessuno. Tabù durante il controllo: 1. La diluizione, il tempo di azione e la temperatura dell'anticorpo primario e dell'anticorpo secondario sono determinati dal pre-esperimento per determinare le condizioni ottimali per le diverse proteine. 2. La soluzione per lo sviluppo del colore deve essere appena configurata e utilizzata e infine viene aggiunto H2O2. 3, DAB ha il potenziale di cancerogenicità, fare attenzione quando si maneggia. Processo di ispezione (A) campione proteico ottenuto: dopo induzione batterica dell'espressione, le cellule possono essere lisate direttamente mediante tampone di caricamento per elettroforesi, cellule eucariotiche più tampone di omogeneizzazione, omogenato meccanico o ultrasonico a temperatura ambiente 0,5-1min. È stato quindi centrifugato a 13.000 g per 15 minuti a 4 ° C. Prendi il surnatante come campione. (2) Elettroforesi: è stato preparato un gel per elettroforesi e sottoposto a SDS-PAGE. (3) Trasferimento: (trasferimento semi-asciutto) 1. Al termine dell'elettroforesi, tagliare la striscia della dimensione appropriata ed equilibrare con il tampone di membrana, 5 min × 3 volte. 2. Trattamento della membrana: la carta da filtro e la membrana NC delle stesse dimensioni della striscia sono state pretagliate e immerse nel tampone di trasferimento per 10 minuti. 3. Pellicola di trasferimento: il dispositivo di trasferimento di pellicola viene posizionato in ordine dal basso verso l'alto secondo l'ordine della lastra di carbone anodico, 24 strati di carta da filtro, pellicola NC, gel, 24 strati di carta da filtro e piastra di carbone catodico. La carta da filtro, il gel e la pellicola NC sono allineati con precisione. Le bolle sono state rimosse in una fase e ad esse è stato applicato un peso di 500 g per asciugare il liquido in eccesso sulla piastra di carbonio. Accendere l'alimentazione, corrente costante 1mA / cm2, trasferire 1,5 ore. Al termine del trasferimento, l'alimentazione viene rimossa e la membrana viene rimossa e la striscia da testare viene tagliata per l'immunoblotting. Le strisce standard proteiche sono state colorate, poste nella soluzione di colorazione della membrana per 50 secondi, quindi decolorate più volte al 50% in metanolo su uno sfondo chiaro, quindi lavate con acqua distillata doppia, asciugate all'aria in due strati di carta da filtro e lasciate a colore I risultati vengono confrontati. (4) Risposta immunitaria: 1. Lavare la membrana con 0,01 M PBS per 5 minuti x 3 volte. 2. Aggiungere la soluzione di rivestimento e agitare delicatamente a temperatura ambiente per 2 ore. 3. Eliminare la soluzione e lavare la membrana con 0,01 M PBS per 5 minuti × 3 volte. 4. Aggiungere l'anticorpo primario (diluito con 0,01 M PBS in un rapporto di diluizione adeguato, il liquido deve coprire tutta la membrana) e lasciare a 4 ° C per più di 12 ore. Nel controllo negativo, l'anticorpo primario è stato sostituito con l'1% di BSA e i passaggi rimanenti erano gli stessi del gruppo sperimentale. 5. Eliminare l'anticorpo primario e l'1% di BSA e lavare la membrana con 0,01 M PBS, 5 min × 4 volte. 6. Aggiungere l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (diluito con 0,01 M PBS al rapporto di diluizione appropriato) e agitare delicatamente per 2 ore a temperatura ambiente. 7. Eliminare l'anticorpo secondario e lavare la membrana con 0,01 M PBS per 5 minuti × 4 volte. 8. Aggiungi la soluzione colorante, evita la luce e sviluppa il colore fino a quando appare la banda.Inserisci la doppia acqua distillata per fermare la reazione. Non adatto alla folla Non adatto alla folla: no. Reazioni e rischi avversi Nessuna complicanza o rischio correlato.