Western blotting

Immunoblotting polega na przeniesieniu białek na błonę, a następnie wykryciu za pomocą przeciwciał. W przypadku znanego białka ulegającego ekspresji odpowiednie przeciwciało może być użyte jako podstawowe przeciwciało do detekcji. Produkt ekspresji nowego genu można wykryć za pomocą części fuzyjnej przeciwciała i ma on zalety dużej zdolności analitycznej, wysokiej czułości, silnej specyficzności itp. Jedna z najczęściej stosowanych metod ekspresji i dystrybucji, takich jak jakościowe i ilościowe wykrywanie antygenów tkankowych, masowe oznaczanie cząsteczek polipeptydu oraz wykrywanie przeciwciał lub antygenów wirusów. Podstawowe informacje Klasyfikacja specjalistyczna: klasyfikacja kontroli wzrostu i rozwoju: badanie biochemiczne Obowiązująca płeć: czy mężczyźni i kobiety stosują post: nie na czczo Wskazówki: Postępuj zgodnie z instrukcjami lekarza. Wartość normalna Brak specjalnej reakcji barwnej. Znaczenie kliniczne Nieprawidłowe wyniki: Istnieje specjalna reakcja barwna, która dowodzi, że istnieje pewne białko. Musisz sprawdzić tłum: sprawdź, czy nie ma określonego białka. Środki ostrożności Tabu podczas sprawdzania: Brak. Tabu podczas sprawdzania: 1. Rozcieńczenie, czas działania i temperatura pierwszorzędowego przeciwciała i drugorzędowego przeciwciała są określane przez eksperyment wstępny w celu ustalenia optymalnych warunków dla różnych białek. 2. Roztwór wywołujący kolor musi być świeżo skonfigurowany i użyty, a na końcu dodawany jest H2O2. 3, DAB może działać rakotwórczo, zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z nim. Proces kontroli (A) otrzymana próbka białka: po bakteryjnej indukcji ekspresji komórki można bezpośrednio lizować przez bufor ładujący do elektroforezy, komórki eukariotyczne plus bufor do homogenizacji, homogenat mechaniczny lub ultradźwiękowy w temperaturze pokojowej 0,5-1 min. Następnie wirowano przy 13 000 g przez 15 minut w 4 ° C. Weź supernatant jako próbkę. (2) Elektroforeza: Żel elektroforezy został przygotowany i poddany SDS-PAGE. (3) Transfer: (transfer półsuchy) 1. Po zakończeniu elektroforezy, przyciąć pasek do odpowiedniego rozmiaru i zrównoważyć buforem membranowym, 5 min x 3 razy. 2. Obróbka membranowa: bibułę filtracyjną i membranę NC tego samego rozmiaru co pasek wstępnie pocięto i zanurzono w buforze do przenoszenia na 10 minut. 3. Folia transferowa: Urządzenie do transferu folii jest umieszczane w kolejności od dołu do góry zgodnie z kolejnością płytki anodowej, 24 warstw bibuły filtracyjnej, folii NC, żelu, 24 warstw bibuły filtracyjnej i płytki węglowej z katodą. Pęcherzyki usunięto w jednym etapie i nałożono na nie ciężar 500 g, aby wysuszyć nadmiar płynu na płycie węglowej. Włącz zasilanie, prąd stały 1mA / cm2, transfer 1,5 godziny. Po zakończeniu transferu moc jest usuwana, membrana jest wyjmowana, a testowany pasek jest cięty pod kątem immunoblottingu. Standardowe paski białkowe wybarwiano, umieszczano w roztworze barwiącym membrany na 50 s, a następnie kilkakrotnie odbarwiono w 50% metanolu do przezroczystego tła, następnie przemyto dwukrotnie wodą destylowaną, wysuszono na powietrzu w dwóch warstwach bibuły filtracyjnej i pozostawiono do barwienia Wyniki są porównywane. (4) Odpowiedź immunologiczna: 1. Przemyć membranę 0,01 M PBS przez 5 minut x 3 razy. 2. Dodaj roztwór do powlekania i delikatnie wstrząśnij w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. 3. Odrzucić roztwór i przemyć membranę 0,01 M PBS przez 5 minut × 3 razy. 4. Dodaj pierwotne przeciwciało (rozcieńczone 0,01 M PBS w odpowiednim stosunku rozcieńczenia, ciecz musi pokryć całą membranę) i pozostawić w 4 ° C na dłużej niż 12 godzin. W kontroli negatywnej pierwotne przeciwciało zastąpiono 1% BSA, a pozostałe etapy były takie same jak w grupie eksperymentalnej. 5. Odrzucić pierwotne przeciwciało i 1% BSA i przemyć membranę 0,01 M PBS, 5 min. × 4 razy. 6. Dodaj drugie przeciwciało sprzężone z peroksydazą chrzanową (rozcieńczone 0,01 M PBS przy odpowiednim stosunku rozcieńczenia) i delikatnie wstrząsaj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. 7. Odrzucić wtórne przeciwciało i przemyć membranę 0,01 M PBS przez 5 min x 4 razy. 8. Dodaj roztwór barwiący, unikaj światła i rozwijaj kolor, aż pojawi się prążek. Dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby zatrzymać reakcję. Nie nadaje się dla tłumu Nie nadaje się dla tłumu: nie. Działania niepożądane i ryzyko Brak powiązanych komplikacji lub zagrożeń.