Izolacja i identyfikacja bakterii beztlenowych

Izolacja i identyfikacja bakterii beztlenowych jest testem na separację i identyfikację bakterii o wysokiej wrażliwości na tlen Ponieważ mikroorganizmy beztlenowe są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie i mają szeroką różnorodność, ich funkcje fizjologiczne zyskały coraz większą uwagę. Obowiązkowe bakterie beztlenowe są bardzo wrażliwe na tlen, dlatego kluczem do ich oddzielenia, hodowli i żywotności jest zapewnienie środowiska hodowli wolnego od tlenu i niskiego potencjału redoks. Podstawowe informacje Klasyfikacja specjalistyczna: klasyfikacja kontroli wzrostu i rozwoju: badanie biochemiczne Obowiązująca płeć: czy mężczyźni i kobiety stosują post: post Wskazówki: Jeśli kolonia jest zbyt mała, użyj lupy, aby obserwować kolonie. Wartość normalna Rodzaj i proporcja flory w ciele są normalne, a ciało ludzkie jest w stanie dynamicznej równowagi i zdrowia. Znaczenie kliniczne Technologia beztlenowej rurki walcowniczej Hengate, technologia beztlenowej rurki walcowniczej Hengate to technologia hodowli beztlenowej po raz pierwszy zaproponowana przez amerykańskiego mikrobiologa Hengate w 1950 r. I zastosowana w badaniach nad bakteriami beztlenowymi w żwaczu. Nieprawidłowe wyniki: specjalne choroby wywołane przez beztlenowce Clostridium, takie jak zgorzel gazowa, tężec, zatrucie jadem kiełbasianym itp. Osoby wymagające badania: pacjenci z cukrzycą, ciężką chorobą wątroby, marskością wątroby, mocznicą, wrzodami hemoroidów, zgorzel kończyn, zatrucie jadem kiełbasianym i innymi objawami. Środki ostrożności W procesie oddzielania i identyfikacji bakterii beztlenowych należy zwrócić uwagę na następujące kwestie: (1) Próbki anaerobowe muszą być izolowane z powietrza podczas pobierania i transportu oraz muszą być wypełnione w ciągu 30 minut, unikając zanieczyszczenia normalnej flory. (2) Pożywkę należy przygotować świeżo, jeśli jest przechowywana zbyt długo, tlen rozpuszcza się na powierzchni lub w pożywce znajduje się nadtlenek, co nie sprzyja rozwojowi bakterii beztlenowych. (3) Jeśli kolonia jest za mała, należy ją obserwować za pomocą szkła powiększającego. (4) Aby wykonać test tolerancji na tlen, wymagane jest wybranie 4 do 5 kolonii o różnych cechach z każdej płytki agarowej, zaszczepienie tlenowych i beztlenowych płytek agarowych z krwią i umieszczenie ich w środowisku tlenowym, dwutlenku węgla i beztlenowym. (5) Jeśli wykonujesz pozakomórkową identyfikację enzymów, musisz mieć wystarczające stężenie bakterii. Proces kontroli Separacja (1) liczba Weź pięć jałowych probówek z wodą i oznacz je markerem, aby wskazać 10-1, 10-2, ... 10-5. (2) rozcieńczenie W beztlenowym, ultra czystym beztlenowym schowku na rękawiczki, sterylną strzykawką narysuj 1 ml dobrze wymieszanej próbki cieczy, dodaj ją do beztlenowej probówki zawierającej wstępnie zredukowaną sól fizjologiczną i wymieszaj równomiernie z oscylatorem. Zrób rozcieńczenie 10-1. Roztwór 1 ml 10-1 pipetowano do osobnej probówki beztlenowej zawierającej 9 ml soli fizjologicznej za pomocą sterylnej strzykawki, aby uzyskać rozcieńczenie 10-2. Rozcieńczany seryjnie 10 razy do 10-6 w celu uzyskania różnych rozcieńczeń próbki. Liczba probówek jest zwykle wybierana przez trzy rozcieńczenia 10-4, 10-5 i 10-6. (3) Separacja rolek 1) Rura toczna Beztlenowe jałowe podłoże agarowe rozpuszczono we wrzącej łaźni wodnej, umieszczono w łaźni wodnej o stałej temperaturze 46–50 ° C i użyto, a gdy podłoże wyjęto z butelki, nadmuchano N2 w pożywce. Następnie napełnij N2 w probówce, usuń całe powietrze z probówki, następnie dodaj medium do probówki i natychmiast zatkaj korek. Po włożeniu korka do rurki igła napełniająca jest wyciągana w odpowiednim czasie. Odmierzyć pipetą 0,1 ml każdego z 10–4, 10–5 i 10–6 rozcieńczeń do probówki, która ma zostać użyta, a następnie umieścić ją płasko na porcelanowej płytce zawierającej lodowatą wodę i szybko zrolować. Solubilizowany agar tworzy zestaloną warstwę bezpośrednio na wewnętrznej ściance probówki. 2) Rozdzielanie i oczyszczanie Powstałe kolonie należy zebrać i zbadać pod kątem morfologii i czystości. Jeśli nie uzyskano czystej kultury, należy ponownie rozcieńczyć probówkę i ponownie wybrać okrężnicę, aż do uzyskania czystej kultury. Pojedyncze kolonie do pobrania są wstępnie obserwowane pod lupą i oznaczone. Medium probówki jest następnie mocowane do odpowiedniego uchwytu, a gumowy korek probówki jest otwierany, a wypełniona gazem igła azotowa o odpowiednim przepływie powietrza i bakterie zabite płomieniem są szybko wkładane do probówki. W tym samym czasie z gumowej zatyczki wyjmowana jest inna płynna rurka beztlenowa i wkładana do innej wysterylizowanej igły odpowietrzającej. Ostrożnie włóż przygotowane kapilary łokciowe do stałego podłoża, zidentyfikuj kolonie, które mają zostać pobrane, delikatnie je odessaj, przenieś do ciekłej probówki i zatyczki. Hodowlę hodowano w 37 ° C przez 24 godziny lub dłużej lub po sprawdzeniu zmętnienia roztworu kultury i zbadaniu czystości wyizolowanej kultury. 3) Rozdzielenie Dash Jeden koniec gumowego korka probówki jest spalany na płomieniu, a igła zasysająca gaz służy do zatkania dyszy. Zanim igła zostanie szybko usunięta, powietrze jest wentylowane przez 15-20 s, a jeden koniec rurki jest spalany przez chwilę na płomieniu. Dokręć korek rury, a zwinięta rura zostanie postawiona i zaizolowana Użyj CO2: H2 = 80: 20. Ponieważ CO2 jest cięższy od powietrza, korek rury nie będzie miał resztek powietrza po otwarciu. Rurkę do rysowania można hodować w 34-37 stopniach, aby hodować kolonie. Identyfikacja szczepów 1 test fermentacji cukru Eksperymenty z fermentacją cukru są najczęściej stosowanymi reakcjami biochemicznymi i są szczególnie ważne w identyfikacji bakterii jelitowych. Większość bakterii może wykorzystywać cukier jako źródło węgla i źródło energii, ale mają one duże różnice w zdolności do rozkładania cukru. Niektóre bakterie mogą rozkładać cukier i wytwarzać kwas (taki jak kwas mlekowy, kwas octowy, kwas propionowy itp.) I gaz (taki jak Wodór, metan, dwutlenek węgla itp .; niektóre bakterie wytwarzają tylko kwas i nie wytwarzają gazu. Na przykład Escherichia coli może rozkładać laktozę i glukozę z wytworzeniem kwasu i gazu; Salmonella typhimurium może rozkładać glukozę z wytworzeniem kwasu i nie wytwarzać gazu, i nie może rozkładać laktozy; wspólny Proteus rozkłada glukozę z wytworzeniem kwasu i wytwarza gaz, który nie może rozkładać laktozy. Wytwarzanie kwasu można określić za pomocą wskaźnika. Purpurę bromokrezolową [pH 5,2 (żółty) - 6,8 (fioletowy)] dodano wcześniej, gdy przygotowano pożywkę, a gdy kwas wytworzono przez fermentację, pożywkę zmieniono z purpurowej na żółtą. Wytwarzanie gazu można wykazać przez obecność lub brak pęcherzyków w odwróconej probówce Dehana w probówce fermentacyjnej. Konkretne etapy eksperymentalne: 1 Ciecz bakteryjna jest odpowiednio rozcieńczana, a następnie w sterylnym środowisku pewna ilość rozcieńczonego roztworu jest wstrzykiwana do probówki identyfikacyjnej biochemicznej i zamykana sterylną folią uszczelniającą. 2 Włóż zaszczepioną rurkę identyfikacyjną do zbiornika beztlenowego i umieść w inkubatorze o stałej temperaturze 37 ° C z wystarczającą ilością azotu. Zmiana koloru i wytwarzanie gazu w każdej probówce obserwowano po 324 godzinach. 2 eksperyment rozkładu białka 1 Ciecz bakteryjna jest odpowiednio rozcieńczana, a następnie w sterylnym środowisku pewna ilość rozcieńczonego roztworu jest wstrzykiwana do probówki identyfikacyjnej biochemicznej i zamykana sterylną folią uszczelniającą. 2 Włóż zaszczepioną rurkę identyfikacyjną do zbiornika beztlenowego i umieść w inkubatorze o stałej temperaturze 37 ° C z wystarczającą ilością azotu. Po 324 godzinach probówki poddano odpowiednio reakcji Mirren, reakcji hydrazyny, żółtej i reakcji płukania ust. 3 doświadczenie hydrolizy skrobi 1 Ciecz bakteryjna jest odpowiednio rozcieńczana, a następnie w sterylnym środowisku pewna ilość rozcieńczonego roztworu jest wstrzykiwana do probówki identyfikacyjnej biochemicznej i zamykana sterylną folią uszczelniającą. 2 Włóż zaszczepioną rurkę identyfikacyjną do zbiornika beztlenowego i umieść w inkubatorze o stałej temperaturze 37 ° C z wystarczającą ilością azotu. Po 324 godzinach do każdej probówki dodano odpowiednią ilość roztworu jodu Lugola, aby obserwować hydrolizę skrobi. Nie nadaje się dla tłumu Brak istotnych informacji. Działania niepożądane i ryzyko Nie znaleziono powiązanych powikłań i zagrożeń.