Durchflusszytometrische DNA-Analyse

Die durchflusszytometrische DNA-Analyse ist eine Untersuchungsmethode, mit der Interphasenzellen untersucht werden können und die nicht vom Zellproliferationsstatus betroffen ist. Sie ist wichtig für den Nachweis bösartiger Zellen beim Pleuraerguss. Durchflußzytometrie-Erfassungsbereich: 1. Durchflußzytometrie kann die Zellstruktur einschließlich Zellgröße, Zellgröße, Zelloberfläche, Nucleoplasma-Verhältnis, DNA-Gehalt und Zellzyklus, RNA-Gehalt, Proteingehalt erfasst werden. 2. Durchflusszytometrie kann zelluläre Funktionen nachweisen, einschließlich Zelloberflächen- / zytoplasma- / kernspezifischer Antigene, zellulärer Aktivitäten, intrazellulärer Zytokine, Enzymaktivitäten, Hormonbindungsstellen und zellulärer Rezeptoren. Grundlegende Informationen Fachklassifikation: kardiovaskuläre Untersuchung Klassifikation: Blutuntersuchung Anwendbares Geschlecht: ob Männer und Frauen Fasten anwenden: nicht Fasten Tipps: Behalten Sie eine normale Denkweise. Normalwert Der Körper ist in einem dynamischen Gleichgewicht ohne Krankheit. Klinische Bedeutung Klinische Anwendung der Durchflusszytometrie: 1. Anwendung der Durchflusszytometrie in der Onkologie Mit der Durchflusszytometrie können Tumorzellproliferationszyklen, Tumorzelloberflächenmarker, Onkogen-Expressionsprodukte, Multidrug-Resistenzanalysen und Apoptose nachgewiesen werden. 2. Anwendung der Durchflusszytometrie in der Hämatologie zum Nachweis von Leukämie- und Lymphomzellen, aktivierten Blutplättchen, hämatopoetischen Stammzellen (CD34 +), Immunphänotypisierung von Leukämien und Lymphomen, Retikulozytenzahl, Kreuzvergleich der Zelltransplantation und Immunstatusüberwachung; 3. Die Durchflusszytometrie in der Immunologie kann für die Analyse von Lymphozyten und deren Untergruppen, die Immunphänotypisierung von Lymphozyten und den Nachweis von Zytokinen verwendet werden. Abnormale Ergebnisse Es gab Daten zur Durchflusszytometrieanalyse von 71 Fällen von Pleuraerguss. Die Ergebnisse zeigten, dass die Sensitivität des malignen Pleuraergusses 52% und die Spezifität 100% betrug. In Verbindung mit Routinetests kann die Sensitivität der Diagnose bis zu 94% betragen. Die DNA-Analyse von krebsartigen Pleuraergusszellen zeigte einen Anstieg des Anteils an Zellen der aneuploiden und S-Phase, G2 / M-Phase. Personen, die untersucht werden müssen, stehen im Verdacht, einen krebsartigen Pleuraerguss und andere verwandte Krankheiten zu haben. Vorsichtsmaßnahmen Die Durchflusszytometrie ist kein vollautomatisches Instrument. Für genaue experimentelle Ergebnisse sind genaue manuelle Techniken erforderlich. Daher ist für die Probenvorbereitung eine Spezifikation und für das Instrument selbst eine Qualitätskontrolle erforderlich. (1) Einflussfaktoren und Qualitätskontrolle des immunologischen Nachweises mittels Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie hat ein breites Anwendungsspektrum in der Immunologie: Die Vorbereitung von Immunfluoreszenz-Färbungsproben ist sehr wichtig, häufig aufgrund des Auftretens anthropogener unspezifischer Fluoreszenzstörungen (insbesondere bei indirekter Immunfluoreszenz-Färbung) oder niedriger Zellkonzentration während der Probenvorbereitung. Testergebnisse. Die Lösungen für diese Einflussfaktoren lauten wie folgt: (1) Stellen Sie sicher, dass die Konzentration der Probe vor dem Nachweis der Maschine 1 × 106 Zellen / ml beträgt und die Zellkonzentration zu niedrig ist, was sich direkt auf das Nachweisergebnis auswirkt. (2) Die Verwendung von Proteinblockierungsmitteln zur Blockierung nicht spezifischer Bindungsstellen ist insbesondere für die indirekte Immunfluoreszenzmarkierung erforderlich. Üblicherweise verwendete Proteinblocker sind 0,5% Rinderserumalbumin und 1% fötales Rinderserum. (3) Der fluoreszierende Antikörper wird nach dem Färben gründlich gewaschen. Achten Sie auf die Misch- und Zentrifugationsgeschwindigkeit und reduzieren Sie überlappende Zellen und Zelltrümmer. (4) Eine Kontrollprobe wurde unter Verwendung einer Hintergrundkontrolle von nicht verwandten Kontroll- und fluoreszierenden Antikörpern hergestellt, die mit der gleichen Antikörperquelle übereinstimmten. (5) Bei der Beurteilung des Ergebnisses sollte auf die Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz geachtet werden.Um die quantitative Analyse der Immunfluoreszenz genauer zu gestalten, wird mit der Computerprogramm-Software der Kurvenpeak der Kontrollgruppe vom Kurvenpeak der Versuchsgruppe durch das Anpassungskurvenverfahren subtrahiert. Genauere quantitative Immunfluoreszenzergebnisse können erhalten werden. (6) Achten Sie darauf, Licht nach dem Färben zu vermeiden, um die Stabilität der zellulären Immunfluoreszenz zu gewährleisten. (2) Es gibt noch keinen einheitlichen Standard für die Qualitätskontrolle der DNA-Ploidie-Analyse. Die in verschiedenen Literaturstellen angegebenen experimentellen Ergebnisse sind sehr unterschiedlich. Im Oktober 1993 entwickelte die American Cancer Research Organization einen einheitlichen Standard für die Bestimmung von FCM-DNA, den wir nach diesen Standards kombinierten. Erfahrene Experten haben jahrelang praktiziert, um die Qualitätskontrolle und Vorsichtsmaßnahmen der DNA-Analysetechnologie von FCM zu erläutern. (1) Wenn frische Proben für die chirurgische Resektion oder Biopsienadeln entnommen werden, sollte das hämorrhagische nekrotische Gewebe vermieden werden. (2) Die Proben sollten rechtzeitig nach der Entnahme fixiert oder kryokonserviert werden, um Autolyse und DNA-Abbau zu vermeiden, was zu Fehlern bei den Testergebnissen führt. (3) Das Fixiermittel sollte eine Konzentration annehmen, die stark in die Gewebezellen eindringt, und 70% des Ethanols sind besser. (4) Achten Sie bei der Herstellung der Einzelzellsuspension darauf, die Komponenten der zu testenden Zellen zu trennen, die Interferenz anderer Komponenten zu verringern und die Zellen nicht zu beschädigen. (5) Die Entnahme von Zellproben sollte eine ausreichende Zellkonzentration gewährleisten, dh 1 × 10 6 Zellen / ml, Verunreinigungen, Trümmer, Klumpen und überlappende Zellen sollten <2% betragen, und mindestens 20% der Proben von Tumorzell-DNA-Aneuploiden sollten analysiert werden. Tumorzellen sind vorhanden. (6) Bei der Herstellung einer einzelnen Zelle aus in Paraffin eingebettetem Gewebe sollte auf die Auswahl des Gewebes ohne Autolyse und Nekrose geachtet werden.Für die Tumorgewebeprobe wird der Bereich ausgewählt, der die Tumorzellen enthält, vorzugsweise sollte die Dicke des Paraffingewebeblattes geeignet sein 40 bis 50 μm. Zu dünne oder zu dicke Scheiben beeinträchtigen die Testergebnisse und werden gründlich entwachst, um zu verhindern, dass Paraffinreste die Verdauungsaktivität des Enzyms beeinträchtigen. Überprüfen Sie, ob das Entwachsen vollständig ist, indem Sie Xylol verwerfen und 100% Ethanol zugeben. Das Schweben zeigt an, dass das Wachs entfernt wurde, die Flüssigkeitszufuhr reicht aus, um das Gewebe in einen Zustand zu versetzen, der dem frischen Gewebe ähnelt, und die Verdauungszeit und die Aktivität der Verdauungsenzyme zu berücksichtigen. Routinemäßig wurde 0,5% Pepsin verwendet, pH 1,5. (3) Betriebliche Aspekte (1) Das Durchflusszytometer befindet sich während des gesamten Arbeitsprozesses in einem optimalen Zustand, wodurch die Genauigkeit und Genauigkeit des quantitativen Nachweises sichergestellt werden kann. Wenn Sie die Standardprobe verwenden, um den Variationskoeffizienten des Instruments auf den minimalen Bereich einzustellen, ist die Auflösung im besten Zustand, um Erkennungsfehler zu vermeiden, die durch Änderungen der Gerätebedingungen während des Messvorgangs verursacht werden. (2) Der wichtige Index für die Bewertung der Genauigkeit des Instruments ist der Variationskoeffizient (CV) des Instruments. Für die Kalibrierungsprobe ist der CV-Wert umso kleiner, je kleiner der CV-Wert ist, was anzeigt, dass die Genauigkeit der Instrumentenkalibrierung höher ist. Kalibrierungsproben umfassen nichtbiologische Proben (fluoreszierende Mikrosphären) und biologische Zellproben (menschliche Lymphozyten, rote Hühnerblutkörperchen usw.). Gegenwärtig haben nicht-biolumineszierende Mikrokugeln kommerzielle Reagenzien und der CV beträgt im Allgemeinen <2% bis 3%. (4) Datenanalyse (1) Wenn sich zu viele Ablagerungen oder Agglomerate in der Probe befinden, liegt die Anzahl der gemessenen Zellen unter 20%, und die Grundlinie des Histogramms sollte verworfen werden. (2) Bei der Durchführung der Zellzyklusanalyse sollte die Anzahl der Probenzellen 10.000 betragen, ausgenommen Ablagerungen, Verunreinigungen und Agglomerate. Wenn die Anzahl der aneuploiden Zellen weniger als 10% der Gesamtzahl der Zellen ausmacht, müssen andere diagnostische Indikatoren kombiniert werden. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass mindestens aneuploide Zellen mehr als 20% der Gesamtzahl der Zellen ausmachen und dass Aneuploide vorhanden sind. (3) Bei der DNA-Analyse wurde die Analyse abgebrochen, wenn der CV-Wert der normalen diploiden Zellgruppe> 8% betrug, der CV-Wert der Tumorzellen jedoch> 8% betrug, was mit der Heterogenität der Tumorzellen zusammenhängt. Zusätzlich driften bei der DNA-Ploidie-Analyse 10% der Individuen im homologen Gewebe. (4) Qualitätskontrolle von DNA-Ploidiestandards unter Verwendung des gleichen homologen Normalgewebes, der gleichen Fixierungsmethode, der gleichen Probenverarbeitungsmethode, der gleichen Färbemethode, gleichzeitiger Färbung, der gleichen Instrumentendetektionsbedingungen, des normalen diploiden Gewebes wie Interner Standard. Inspektionsprozess Durchflusszytometrieanalyse: Zellen in der Pleuraflüssigkeit wurden direkt mit fluoreszierenden Farbstoffen (wie Propidiumiodid) angefärbt, und der DNA-Gehalt, die Zellzyklusverteilung und die DNA-Ploidie der Pleuraflüssigkeitszellen wurden durch Durchflusszytometrie analysiert. Probenvorbereitung für Routinetests mittels Durchflusszytometrie: (1) Direkte Immunfluoreszenzmarkierung Nehmen Sie eine bestimmte Menge an Zellen (ca. 1 × 10 6 Zellen / ml), geben Sie den Fluorescein-konjugierten Antikörper direkt für die Immunmarkierungsreaktion hinzu (z. B. doppelt oder mehrfach markierte Färbung, geben Sie mehrere mit verschiedenen Fluorescein-markierte Antikörper gleichzeitig hinzu), inkubieren Sie Nach 20 bis 60 Minuten 1 oder 2 Mal mit PBS (pH 7,2 bis 7,4) waschen, in Puffer resuspendieren und auf der Maschine testen. Das Verfahren hat den Vorteil einer einfachen Bedienung, eines genauen Ergebnisses und einer einfachen Analyse und eignet sich zur gleichzeitigen Bestimmung mehrerer Parameter derselben Zellgruppe. Obwohl die Kosten für das direkt markierte Antikörperreagenz hoch sind, verringert es die Störung durch starke unspezifische Fluoreszenz bei der indirekten Markierungsmethode und ist daher besser für den Nachweis von klinischen Proben geeignet. (zwei) indirekte Immunfluoreszenzmarkierung Nehmen Sie eine bestimmte Menge Zellsuspension (etwa 1 × 106 Zellen / ml), geben Sie zuerst einen spezifischen ersten Antikörper hinzu, waschen Sie den ungebundenen Antikörper nach Beendigung der Reaktion und geben Sie dann einen fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper hinzu, um einen Antigen-Antikörper-Antikörper-Komplex zu bilden Das FCM erkennt die von dem markierten Fluorescein emittierte Fluoreszenz, nachdem es angeregt wurde. Das Verfahren ist kostengünstig und der Sekundärantikörper ist weit verbreitet und wird hauptsächlich zum Nachweis von wissenschaftlichen Proben verwendet. Da der sekundäre Antikörper im Allgemeinen ein polyklonaler Antikörper ist, ist die Spezifität schlecht und der nicht spezifische fluoreszierende Hintergrund ist stark, was die experimentellen Ergebnisse leicht beeinflusst. Daher sollte der Probenvorbereitung eine Negativ- oder Positivkontrolle zugesetzt werden. Aufgrund der großen Anzahl von Schritten bei der Standard-Markierungsmethode ist außerdem der Zellverlust erhöht und es ist nicht geeignet, Proben mit einer kleinen Anzahl von Zellen zu messen. Nicht für die Menge geeignet Nr