Western-Blotting

Immunoblotting ist der Transfer von Proteinen auf eine Membran und der anschließende Nachweis mit Antikörpern. Für das bekannte exprimierte Protein kann der entsprechende Antikörper als Primärantikörper zum Nachweis verwendet werden.Das Expressionsprodukt des neuen Gens kann durch den Fusionsanteil des Antikörpers nachgewiesen werden und hat die Vorteile einer großen Analysekapazität, einer hohen Empfindlichkeit, einer starken Spezifität usw. Eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Expression und Verteilung, wie der qualitative und quantitative Nachweis von Gewebeantigenen, die Massenbestimmung von Polypeptidmolekülen und der Nachweis von Antikörpern oder Antigenen von Viren. Grundlegende Informationen Fachklassifizierung: Wachstums- und Entwicklungskontrolle Klassifizierung: Biochemische Untersuchung Anwendbares Geschlecht: ob Männer und Frauen Fasten anwenden: nicht Fasten Tipps: Befolgen Sie die Anweisungen des Arztes. Normalwert Keine spezielle Farbreaktion. Klinische Bedeutung Abnormale Ergebnisse: Es gibt eine spezielle Farbreaktion, die beweist, dass ein bestimmtes Protein vorhanden ist. Müssen Sie die Menge überprüfen: Überprüfen Sie für ein bestimmtes Protein. Vorsichtsmaßnahmen Tabu beim Prüfen: Keine. Tabu beim Prüfen: 1. Die Verdünnung, Einwirkungszeit und Temperatur des primären Antikörpers und des sekundären Antikörpers werden vor dem Experiment bestimmt, um die optimalen Bedingungen für verschiedene Proteine ​​zu bestimmen. 2. Die Farbentwicklungslösung muss frisch konfiguriert und verwendet werden, und schließlich wird H2O2 hinzugefügt. 3, DAB hat das Potenzial für Karzinogenität, seien Sie vorsichtig bei der Handhabung. Inspektionsprozess (A) Proteinprobe erhalten: Nach bakterieller Induktion der Expression können die Zellen direkt durch Elektrophoresebeladungspuffer, eukaryotische Zellen plus Homogenisierungspuffer, mechanisches Homogenisat oder Ultraschall-Raumtemperatur-Homogenisat von 0,5 bis 1 min lysiert werden. Es wurde dann 15 Minuten bei 13.000 g und 4 ° C zentrifugiert. Nehmen Sie den Überstand als Probe. (2) Elektrophorese: Ein Elektrophoresegel wurde hergestellt und einer SDS-PAGE unterzogen. (3) Übertragung: (halbtrockene Übertragung) 1. Schneiden Sie den Streifen nach Beendigung der Elektrophorese auf die entsprechende Größe und äquilibrieren Sie ihn mit dem Membranpuffer 5 min × 3 mal. 2. Membranbehandlung: Das Filterpapier und die NC-Membran der gleichen Größe wie der Streifen wurden vorgeschnitten und 10 Minuten lang in den Transferpuffer eingetaucht. 3. Transferfolie: Die Folienübertragungsvorrichtung wird in der Reihenfolge der Anodenkohleplatte, 24 Schichten Filterpapier, NC-Folie, Gel, 24 Schichten Filterpapier und Kathodenkohleplatte von unten nach oben angeordnet, wobei Filterpapier, Gel und NC-Folie genau aufeinander abgestimmt sind. Die Blasen wurden in einem Schritt entfernt und ein Gewicht von 500 g wurde darauf aufgebracht, um die überschüssige Flüssigkeit auf der Kohlenstoffplatte zu trocknen. Schalten Sie die Stromversorgung ein, konstanter Strom 1mA / cm2, übertragen Sie 1,5 Stunden. Nachdem die Übertragung abgeschlossen ist, wird der Strom entfernt und die Membran herausgenommen, und der zu testende Streifen wird zum Immunblotting geschnitten. Die Proteinstandardstreifen wurden gefärbt, 50 s in die Membranfärbelösung gegeben und dann mehrmals in 50% igem Methanol bis zu einem klaren Hintergrund entfärbt, dann mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen, in zwei Schichten Filterpapier luftgetrocknet und färben gelassen Die Ergebnisse werden verglichen. (4) Immunantwort: 1. Wasche die Membran 5 min x 3 mal mit 0,01 M PBS. 2. Fügen Sie die Beschichtungslösung hinzu und schütteln Sie sie 2 Stunden bei Raumtemperatur. 3. Verwerfen Sie die Lösung und waschen Sie die Membran dreimal 5 Minuten lang mit 0,01 M PBS. 4. Primärantikörper hinzufügen (verdünnt mit 0,01 M PBS in einem geeigneten Verdünnungsverhältnis, die Flüssigkeit muss die gesamte Membran bedecken) und länger als 12 Stunden bei 4 ° C stehen lassen. In der Negativkontrolle wurde der Primärantikörper durch 1% BSA ersetzt und die restlichen Schritte waren die gleichen wie in der Versuchsgruppe. 5. Den Primärantikörper und 1% BSA verwerfen und die Membran mit 0,01 M PBS 5 min × 4 mal waschen. 6. Fügen Sie Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörper (verdünnt mit 0,01 M PBS im geeigneten Verdünnungsverhältnis) hinzu und schütteln Sie ihn vorsichtig 2 Stunden lang bei Raumtemperatur. 7. Den sekundären Antikörper verwerfen und die Membran mit 0,01 M PBS 5 min × 4 mal waschen. 8. Fügen Sie die Farbstofflösung hinzu, meiden Sie das Licht und entwickeln Sie Farbe, bis die Bande erscheint. Geben Sie doppelt destilliertes Wasser hinein, um die Reaktion zu stoppen. Nicht für die Menge geeignet Nicht für die Menge geeignet: Nein. Nebenwirkungen und Risiken Keine verwandten Komplikationen oder Gefahren.